蜜柚间座壳黑点病菌（Dia...AMP可视化检测技术的建立_赖宝春.pdf

赖宝春，姚锦爱.蜜柚间座壳黑点病菌（Diaporthe citri）LAMP 可视化检测技术的建立J.福建农业学报，2022，37（11）：14701475.LAIBC,YAOJN.EstablishmentofaLAMPAssayforRapidDetectingDiaporthe citri onPomeloJ.Fujian Journal of Agricultural Sciences，2022，37（11）：14701475.蜜柚间座壳黑点病菌（Diaporthe citri）LAMP 可视化检测技术的建立赖宝春1，姚锦爱2*（1.漳州市农业科学研究所，福建漳州363005；2.福建省作物有害生物监测与治理重点实验室/福建省作物有害生物绿色防控工程研究中心/福建省农业科学院植物保护研究所，福建福州350013）摘要：【目的】建立一种蜜柚间座壳黑点病菌快速、简便、灵敏的 LAMP（Loopmediatedisothermalamplification）可视化检测方法，在植株表现症状之前或初期实现病原菌的监测，为病害的早期监测、诊断及防治提供依据。【方法】以 EF-1a（Elongation factor-1）基因序列为靶序列，设计了一套 LAMP 特异性引物；以蜜柚黑点病菌DNA 为模板，优化反应温度和反应时间，建立 LAMP 检测反应体系，开展特异性和灵敏度验证及田间病株检测。【结果】建立的 LAMP 反应体系可特异有效地检测出蜜柚黑点病菌。该体系最佳反应温度、反应时间分别为 65和 60min。灵敏度验证结果表明，LAMP 检测最小质量浓度为 10fgL1。采用 LAMP 法对 15 份疑似蜜柚黑点病田间样本进行快速检测，检出率为 100%。【结论】本研究建立的蜜柚间座壳黑点病菌 LAMP 快速检测方法不仅特异性强、灵敏度高，且检测结果可视，可用于田间黑点病菌的实时监测和快速检测。关键词：蜜柚；黑点病；间座壳菌；环介导等温核酸扩增技术；检测中图分类号：S436文献标志码：A文章编号：1008-0384（2022）11147006Establishment of a LAMP Assay for Rapid Detecting Diaporthe citri on PomeloLAIBaochun1,YAOJinai2*（1.Zhangzhou Institute of Agricultural Sciences,Zhangzhou,Fujian363005,China;2.Fujian Key Laboratory for Monitoringand Integrated Management of Crop Pests/Fujian Engineering Research Center for Green Pest Management,Institute of PlantProtection,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou,Fujian350013,China）Abstract:【Objective】Aloop-mediatedisothermalamplification(LAMP)methodforvisual,rapid,andaccuratedetectionofDiaporthe citri onpomelosinearlystageofblackspotdiseasewasdeveloped.【Method】Basedontheelongationfactor-1(EF-1)sequenceofD.citri,asetofLAMPprimerswasdesigned.TemplateDNAfromtheinfectedleaveswasusedtoestablishtheoptimaltemperatureandtimefortheLAMPoperation.Assayspecificityandsensitivitywereverifiedbypositivedetectionoftheinfectedplantsinthefield.【Result】ThenewlyestablishedLAMPmethodcouldeffectivelyandspecificallydetect D.citri onpomeloattheoptimaltemperatureof65with60mforthereactiontime.Thedetectionlimitoftheassayon D.citri was10fgL1.On15fieldsampleswiththetypicalblackspotsymptoms,a100%positivedetectionratewasachievedbytheLAMPassay.【Conclusion】TheestablishedvisualandrapidLAMPassaydemonstratedahighspecificity,sensitivity,andperfectdetectionofD.citriondiseasedpomelo.Itwasconsideredappropriateforfieldapplication.Key words:Pomelo；blackspot；Diaporthe citri；loop-mediatedisothermalamplification；detection收稿日期：20220901初稿；20221010修改稿作者简介：赖宝春（1979），女，副研究员，主要从事植物病害生物防治研究（E-mail：）*通信作者：姚锦爱（1978），女，研究员，主要从事植物病害生物防治研究（E-mail：）基金项目：福建省科技计划项目（2020N0057）；福建省农业科学院科技创新团队建设项目(STTT2021-2-2)；福建省农业高质量发展超越“5511”协同创新工程项目(XTCXGC2021017、XTCXGC2021011)福建农业学报2022，37（11）：14701475http:/Fujian Journal of Agricultural Sciencesdoi:10.19303/j.issn.1008-0384.2022.011.0130引言【研究意义】蜜柚是漳州平和县的地方名果，至今已有 500 多年的栽培历史，在清代乾隆年间被列为清廷贡品。其味道酸甜，含有丰富的维生素C 及大量营养元素，是现代人追求健康的理想食物。1995 年平和县被命名“中国琯溪蜜柚之乡”，2007 年 琯 溪 蜜 柚 被 认 定 为 中 国 驰 名 商 标。2008年，琯溪蜜柚被认定为中国名牌农产品，并被欧盟列为地理标志保护品种。平和县成为中国柚类第一大县，被誉为“世界柚乡”“中国柚都”。自 20 世纪80 年代开始大面积种植，主要销往欧盟、北美、俄罗斯、东南亚等 40 多个国家和地区。全县现有 40 多万人从事与蜜柚相关的工作，占家庭经济收入的50%，已成为促进财政增加、农村发展、农民增收、助力乡村振兴的支柱产业1。蜜柚黑点病又称砂皮病、树脂病、褐色蒂腐病，由间座壳属（Diaporthe）真菌引起，该属真菌是一类非常重要的植物病原真菌类群，它们侵染蜜柚的叶片、果实和枝干的表面，由于寄主的抗病反应，分泌胶质，干燥后形成凸起的细小坚硬的斑点，通常称之为黑点病，严重时果实表面形成沙皮症状。在一些山地果园，该病的为害降低果实外观品质尤为突出，也可引起储运期间烂果，发病果园的病果率一般为 5%30%，严重时达 80%100%2。目前蜜柚黑点病防治存在的问题日益凸显，一是单纯依靠化学农药，不重视其他防治方法；二是果园管理粗放，生态环境脆弱。这些问题加重了病害的发生3。因此，为解决上述问题，生产上迫切需要建立一种快速、准确检测蜜柚黑点病菌的方法。在蜜柚果园管理中对黑点病的发生进行实时监测检测，通过监测和检测可以提早做好预测预报，做到早预防，早治疗，可大大减轻病害发生及传播。【前人研究进展】环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是日本学者 Notomi 公开发表的适用于基因鉴定的核酸扩增技术。在 6065 恒温以及链置换 DNA 聚合酶催化的条件下，特异性地针对靶基因的 6 个区域设计 LAMP 引物，能与目标序列的两端结合循环产生环状单链结构，不断地合成新链，1560min即可实现目标基因高效扩增，可将目的基因片段扩增到 1091010个数量级，反应中产生副产物焦磷酸镁沉淀可通过肉眼观察，可以看到明显的白色沉淀，为了更加准确地对副产物焦磷酸镁沉淀进行定时定量的监控，可通过实时浊度仪检测浊度和 SYBR染色检测来观察结果46。LAMP 方法和 PCR 反应相比，其优点在于不需要进行反复热变性和反复升降温这样繁琐且时间较长的操作过程，反应体系置于恒温条件下就可进行持续的快速扩增，经济、便捷，且反应体系稳定可靠。针对基因的 6 个位点进行识别，使其具有很高的灵敏性和特异性，并且能够快速检测病原菌，不受污染样品和干扰片段的影响7。目 前 该 检 测 技 术 已 成 功 应 用 于 炭 疽 菌 属Colletotrichumspp.、镰刀菌属 Fusariumspp.、疫霉菌属 Phytophthoraspp.等植物病原真菌的快速检测810。【本研究切入点】LAMP 检测技术应用于琯溪蜜柚黑点病菌 Diaporthe citri 检测的研究有待深入探讨。【拟解决的关键问题】为了获得特异性和灵敏度高的可用于蜜柚间座壳黑点病菌 LAMP 检测的特异性引物，本研究选取在间座壳菌种的水平上信息丰富保守基因 EF-1a（Elongation factor-1）为靶点，对D.citri 的 EF-1a 基因和其他间座壳属真菌的序列进行差异性分析，选取 6 个特定区域，设计了 4 条特异性的 LAMP 引物，建立一种 LAMP 可视化检测方法，以期在蜜柚黑点病发生初期实现病原菌的实时监测和快速准确检测，为病害的早期防控提供依据。1材料与方法1.1试验材料及 DNA 提取供试菌株包括间座壳黑点病菌 Diaporthe citri、蜜柚炭疽病菌 Colletotrichum gloeosporioides、细极链格孢菌 Alternaria tenuissima、禾谷镰孢菌 Fusariumgraminearum、大斑凸脐蠕孢 Exserohilum turcicum、直立帚枝杆孢 Sarocladium strictum 和蜜柚黑斑病菌Phyllosticta citriasiana。病原菌在装有 100mL 马铃薯葡萄糖液体培养基（每升蒸馏水中含 200g 马铃薯，20g 葡萄糖）的 250mL 三角烧瓶中，在 26 恒温摇床 150rmin1培养 56d；真空过滤收集各菌株菌丝，后冻干 48h，用 DNA 提取试剂盒（天根生物技术有限公司）提取各菌株基因组 DNA，DNA 浓度使用 NanoDrop2000C 分光光度计测定（ThermoFischerScientific,USA），DNA 作为 LAMP 检测的模板用无菌双蒸馏水按要求稀释。1.2引物设计及合成采用 DNAStar6.0 软件对间座壳菌（Diaporthecitri）DNA 序列进行比对，利用在线 LAMP 引物设计软件 PrimersoftwareExplorerV4（http:/primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html;EikenChemicalCo.,Japan）对蜜柚间座壳黑点病菌的高度保守区域 RDRP 和 NP 序列进行引物设计。特异性 LAMP 引物组，包括 1 对外侧引物 F3/B3 和 1 对内侧引物 FIP/BIP 组成，引物序列由上海生工生物技术有限公司合成：F3:5-ACG第11期赖宝春等：蜜柚间座壳黑点病