面向微生物遗传操作的编辑序列设计工具的研究进展_杨毅.pdf

2023 年 第 4 卷 第 1 期|Synthetic Biology Journal 2023，4（1）：30-46面向微生物遗传操作的编辑序列设计工具的研究进展杨毅1，毛雨丰1，杨春贺1，2，王猛1，廖小平1，马红武1（1 中国科学院天津工业生物技术研究所中国科学院系统微生物工程重点实验室，天津300308；2 天津科技大学生物工程学院，天津300457）摘要：以同源重组、CRISPR等为代表的遗传操作技术是合成生物学的重要支撑技术。高效准确的遗传操作依赖于可准确定位编辑位点和实现序列改造的编辑序列（如引物序列、同源臂序列、sgRNA序列等）。由于遗传改造目标与遗传操作技术丰富多变，加之近年来基于生物铸造厂（BioFoundry）的自动化遗传改造模式对高通量设计的需求日益增加，使得通过计算机辅助设计工具实现精准快速的编辑序列设计愈发重要。本文针对不同阶段实现不同目标的微生物遗传操作技术和相应的编辑序列辅助设计工具的发展进行了综述。按照不同编辑序列类型和遗传操作应用场景，将编辑序列设计工具划分为四种类型：引物设计工具、DNA组装的设计工具、sgRNA设计工具、基因组编辑的全流程设计工具，对各类编辑序列设计工具的应用及存在的问题进行了分析总结并对未来的研究方向进行了展望。编辑序列设计工具的发展将有助于实现合成生物学“设计构建测试学习”（design-build-test-learn，DBTL）工作循环中上游的基因型“设计”与下游“构建”两个关键环节之间的无缝衔接。关键词：编辑序列；DNA组装；基因组编辑；全流程设计；生物工厂中图分类号：Q939.97 文献标志码：ARecent progress in computational tools for designing editing sequences used in microbial genetic manipulationsYANG Yi1，MAO Yufeng1，YANG Chunhe1，2，WANG Meng1，LIAO Xiaoping1，MA Hongwu1（1Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China；2College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）Abstract:Genetic manipulations such as homologous recombination and CRISPR are basic technologies of synthetic biology aiming to design and construct artificial life.One key factor affecting the efficiency and accuracy of microbial genetic manipulations is the editing sequences(ES),namely the assisting sequences used for precisely locating and editing a target sequence in a genome,such as a primer,a homologous arm or a sgRNA sequence.For different genetic manipulation technologies,diverse manipulation types and multiple ESs are required for different stages of 收稿日期：2022-10-03 修回日期：2022-11-23基金项目：国家重点研发计划“合成生物学”重点专项（2018YFA0902900）；国家自然科学基金（32101186）；中国科学院青年创新促进会；天津市合成生物技术创新能力提升行动项目（TSBICIP-PTJS-001，TSBICIP-KJGG-005）引用本文：杨毅，毛雨丰，杨春贺，王猛，廖小平，马红武.面向微生物遗传操作的编辑序列设计工具的研究进展 J.合成生物学，2023，4（1）：30-46Citation：YANG Yi，MAO Yufeng，YANG Chunhe，WANG Meng，LIAO Xiaoping，MA Hongwu.Recent progress in computational tools for designing editing sequences used in microbial genetic manipulations J.Synthetic Biology Journal，2023，4（1）：30-46DOI:10.12211/2096-8280.2022-055特约评述第 4 卷 manipulation processes,especially for the high-throughput design with recently developed biofoundries to enable automatic strain modifications.Therefore,it is becoming essential to use computational tools for precise,fast,high-throughput and whole workflow ES design.This article reviews tools for ES design at different stages using various microbial genetic manipulation technologies.The tools are classified into four categories based on the types of ESs and their application scenario:primer design,DNA assembly design,sgRNA design and whole workflow ES design.We first give a brief introduction to the tools used for basic primer design with an emphasis on the widely used open-source tool Primer3.Then we have an extensive discussion on the tools used in the design of ESs for DNA assembly using technologies like Gibson and Golden Gate assembly which are required for linking the editing sequences and/or the inserted sequences together as one big fragment to be transformed into target strains.Various tools for designing sgRNA used in the latest CRISPR technologies for genome and base editing are also evaluated and compared in detail.Moreover,we argue that one-stop ES design tools which integrate various design methods to cover the whole genetic manipulation workflow would be very important in addressing challenges for the high throughput design raised by automatic strain construction biofoundries to enable highly precise and efficient genome editing for different sequence manipulations at any location and in any organism.These ES design tools will seamlessly link the genotype“Design”step and the strain“Build”step in the“design-build-test-learn(DBTL)”working cycle of synthetic biology to facilitate the creation of artificial organisms.Keywords:editing sequences;DNA assembly;genome editing;whole workflow design;biofoundry合成生物学的一个重要目标是通过遗传操作技术创制具备理想新功能的人工生命，例如可以高效生产目标化合物的工程菌种。自1974年首个基因工程微生物面世以来1，遗传操作技术与相应的菌种构建能力的升级迭代历经了多个发展阶段（图1）：基于限制性内切酶的经典DNA组装031合成生物学 第 4 卷技术，构建质粒或者重组DNA片段，对目标基因进行单基因克隆1-2、失活或者染色体插入3，可以支持对单基因或者基因簇的扰动，探究其对菌株生理性状或者产品生成的影响；凭借经典同源重组技术和新兴的 DNA组装技术4-5（Gibson、Golden Gate等），可迭代地编辑（插入、敲除与替换）基因组靶序列6-7，可以支持以某一具体性状目标（快速生长或者产品高效生成）的多基因同时克隆和多轮迭代菌种改良；基于新兴的基因组编辑技术8-10（CRISPR/Cas 同源重组与碱基编辑等），进行与大片段组装，实现精准高效的基因组多位点迭代编辑，缩短了菌种构建改良的研发周期；基于自动化装备的合成生物铸造厂（biofoundry）11-13，自动化高通量地进行基因克隆与基因组多位点迭代编辑以同步构建针对不同应用需求的大批量菌株，有望变革传统的劳动密集型的研究范式，创建出自动化与高通量的工程菌种铸造模式。各种遗传操作技术中，用于精准定位与编辑目标 DNA 序列的相关序列可以被称为编辑序列14，例如用于定位和扩增目标DNA序列的引物序列、用于定位和等位替换基因组上目标DNA序列的同源臂序列、用于定位和导引Cas酶的sgRNA序列等。编辑序列设计，即按照合理的规则和逻辑设计功能优化的编辑序列，以确保预期的编辑效率和精准度。例如，设计位置和长度合适的同源臂序列，以实现改造后序列在参考基因组上的精确定位和高效替换；设计参数（熔解温度、二级结构生成倾向、二聚体生成倾向等）优化的引物序列，以通过PCR高成功率的获得同源臂序列。早期的编辑序列设计主要是引物设计，就已经包含很多涉及复杂算法或者大规模计算的步骤，例如引物设计中基于多因素评价指标和复杂评价规则的评分和层级筛选过程，往往需要借助诸如Primer315等专业的计算机辅助设计工具才能得到定量的优化结果。随着遗传操作技术的迭代升级和新操作技术新变种的不断开发，编辑序列的复杂度与范畴随之变化，面向不同应用场景的编辑图图1遗传操