绵羊microRNAs靶向...F_3'UTR基因区域分析_曹鑫艳.pdf

2022年11月摘要：为了探讨绵羊 microRNAs(miRNAs)是否靶向 TNF 3UTR 区域，以及初步确定 miRNAs 靶向其基因的区域，笔者以绵羊 miRNAs为研究对象，利用 PCR 方法克隆 TNF 3UTR(3非翻译区)，应用 mi-Randa 软件分析 miRNAs 靶向 TNF 3UTR 基因的具体区域和结合能力。结果表 明，成 功 克 隆 TNF 3 UTR，大 小 为 500 bp；miR-125b、let-7b 和 let-7c 同时靶向 TNF 3UTR 基因，表明宿主miRNAs 具有潜在的靶向抑制 TNF 3UTR 基因表达的能力，初步明确 miRNAs 靶向 TNF 3UTR 基因的具体区域，为进一步探讨miRNAs 调节 TNF 3UTR 表达提供了基础资料。关键词：TNF；microRNAs；miRanda；3非翻译区MicroRNAs(miRNAs)是一种长 1825 nt 的非编码 RNA，广泛参与宿主基因表达调控1。miRNAs往往通过靶向目的基因 mRNA 的 3非编码区(3Untranslated Region，3UTR)和基因编码区(Codingsequence，CDS)发挥调节作用。miRNAs 将 Arg-onaute(AGO)蛋白复合物募集到互补的靶 mRNA上，从而导致 mRNA 的翻译抑制或降解，进而调控基因表达2-3。研究表明，宿主 miRNAs 不但能调控宿主基因的表达，还参与众多生物学过程4。肿瘤坏死因子(TNF)是一种可以杀伤肿瘤细胞的细胞因子，可以引起机体产生抗感染的炎症反应，对机体的免疫系统起到调控作用5。肿瘤坏死因子分为 TNF-和 TNF-2 种类型。TNF-主要由巨噬细胞分泌，而 TNF-来源于 T 淋巴细胞，他们的结构不同，但是生物学功能极为相似，目前将 TNF 称作 TNF-5。有研究表明，绵羊肺炎支原体感染(MO)可诱导产生高水平的 TNF-。然而，TNF-产生的机制尚不明确6。据报道，糖尿病体内和体外 miRNA-497 治疗降低了代表性的促炎细胞因子，例如 TNF-、IL-1和 IL-67。研究人员在骨关节炎疾病模型中发现，过表达 miR-93 增强了细胞活力，改善了细胞凋亡并减弱了炎症反应，其中 TNF-、IL-1 和 IL-6 分泌量绵羊 microRNAs 靶向 TNF 3UTR 基因区域分析曹鑫艳1魏立翔1高之煜1刘良波1张 辉1闫卫疆2肖 非2孙雪梅2盛金良1张彦兵1,2*孙延鸣1*1.石河子大学动物科技学院(新疆石河子 832003)2.新疆泰昆集团股份有限公司(新疆昌吉 831203)中图分类号：S826，Q343.1文献标识码：B文章编号：1002-2996(2022)11-0032-04Analysis of Sheep microRNAs Target the Region of TNF 3UTR GeneCAO Xin-yan1，WEI Li-xiang1，GAO Zhi-yu1，LIU Liang-bo1，ZHANG Hui1，YAN Wei-jiang2，XIAO Fei2，SUN Xue-mei2，SHENG Jin-liang1，ZHANG Yan-bing1，2*，SUN Yan-ming1*(1.College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832003，China；2.Xinjiang Tycoon Group Co.，Ltd.，Changji 831203，China)Abstract：In order to investigate whether sheep microRNAs(miRNAs)target the TNF 3-untranslated region(3UTR)，and to prelimi-narily determine the region of miRNAs targeting their genes，sheep miRNAs were used as the research object；TNF 3UTR was clonedby PCR method，and miRNAs targeting TNF 3UTR and binding capacity to the TNF 3UTR gene were analyzed by miRanda software.The results showed that TNF 3UTR was successfully cloned with a size of 500 bp；miR-125b，let-7b and let-7c simultaneously target-ed the TNF 3UTR gene，indicating that host miRNAs have potential targets to inhibit the expression of TNF 3UTR gene.The ability ofmiRNAs to target the specific region of TNF 3UTR gene is preliminarily identified，which provides basic data for further research on theregulation of TNF 3UTR expression by miRNAs.Key words：TNF；microRNAs；miRanda；3UTR兽医科技322022年11月减少8。MiR-20a 可使类风湿性关节炎(RA)的成纤维细胞样滑膜细胞释放促炎因子7。在稳定型冠状动脉疾病(SCAD)研究中发现，miR-146a 表达水平与SCAD 患者的 TNF-水平呈负相关关系9。宿主 miRNAs 在调节炎性反应中发挥重要作用。然而，绵羊 miRNAs 靶向调节 TNF-的研究未见报道。笔者利用 miRanda 软件分析绵羊 miRNAs靶向 TNF 3UTR 的具体区域以及结合能力，为后续研究绵羊感染病原菌过程中 TNF-表达的机制提供基础资料。1试验材料与方法1.1试剂DNA marker、DNA 凝胶回收试剂盒购自南京诺维赞生物科技有限公司；50TAE 购自生工生物有限公司；PCR 扩增高保真酶、琼脂糖购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。1.2绵羊 miRNAs 信息在miRbase(http：/www.miRbase.org/index.shtml)数据库下载绵羊 miRNAs 成熟序列。miRNAs具体信息见表 1。1.3绵羊 TNF 3UTR 基因序列下载进入 NCBI(https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库，搜索绵羊 TNF-全基因序列，选择 sheep tumornecrosis factor alpha(NC_056073)的全基因序列，获取 TNF3UTR 序列设计扩增引物(见表 2)。引物由生工生物有限公司合成。1.4绵羊 TNF 3UTR 区域扩增及序列分析提取绵羊肺组织 DNA 作为模板，利用翌圣生物公司高保真酶扩增绵羊 TNF 3UTR。具体扩增体系如下：ddH2O 19.5 L、上下游引物各 2 L、2CanaceRGold PCR buffer(含 Mg2+，dNTPs)25 L、DNA 模板 1 L(50 ng)、Hieff CanaceRGoldHigh-FidelityDNAPolymerase(2U/L)0.5L。反应程序：预变性 95 5 min，进入 35 个循环95 15 s，65 30 s，72 30 s；最后 72 5 min。对PCR 产物进行琼脂糖凝胶分析，按照胶回收 DNA纯化试剂盒说明回收 DNA 并测序。1.5miRNAs 靶向绵羊 TNF 3UTR 基因区域预测在 windows 环境下，打开 CMD(命令提示符)输入运行 miRanda 软件的 CMD 代码10。启动 miRan-da 软件，分别分析 miR-125b、let-7b、let-7c 等 20 个miRNAs 在绵羊 TNF 3UTR 基因序列中的靶向区域。2试验结果2.1绵羊 TNF 3UTR 序列扩增笔者以绵羊肺组织 DNA 为模板成功扩增了TNF 3UTR，扩增片段大小为 500 bp，与预期大小相符合(见图 1)。胶回收后测序比对，发现成功克隆了TNF 3UTR。表 1miRNAs 序列信息名称序列长度/ntoar-m i R-125b5-U CCCU G A G A CCCU A A CU U G U G-321oar-l et-7b5-U G A G G U A G U A G G U U G U G U G G U-321oar-l et-7c5-U G A G G U A G U A G G U U G U A U G G U U-322oar-m i R-370-5p5-CA G G U CA CG U CU CU G CA G U U A C-322oar-m i R-665-3p5-A CCA G U A G G CCG A G G CCCCU CA-322表 2引物序列名称序列长度/bppG L3-TN F3U TRF5-A A G A TCG CCG TG TA A TTCTA G Aggcgcaggacat gcat cct ct cc-345pG L3-TN F3U TRR5-G CCG G CCG CCCCG A CTCTA G Acact t t at t t ct cgccact gaccag-346注：D L2000 为 D N A分子量 m arker；1 和 2 为扩增的 TN F3U TR；3 为阴性对照。图 1TNF-基因 3UTR 扩增结果兽医科技332022年11月2.2oar-miR-125b 靶向 TNF 3UTR 基因分析利用 miRanda 软件预测 oar-miR-125b 靶向 TNF3UTR 基因区域，可靶向 3 个区域：靶向 TNF3UTR792809 区域，其 Score 值为 108，自由能(Energy)为-24.370001kCal/Mol；靶向 TNF3UTR848869 区域，其 Score 值为 97，自由能为-20.219999kCal/Mol；靶向TNF3UTR 941961 区域，其 Score 值为 94，自由能为-23.090000kCal/Mol。因此，oar-miR-125b 具有潜在抑制 TNF基因表达的作用(见图 2)。2.3oar-let-7b、oar-let-7c 靶向 TNF 3UTR 基因分析通过预测分析，发现 oar-let-7b 和 oar-let-7c 均可靶向 TNF 3UTR 基因区域。其中，oar-let-7b 靶向TNF 3UTR 基因 11201143 区域，Score 值为 94，自由能为-20.309999kCal/Mol；oar-let-7c 靶向TNF 3UTR 712736、13101336 区域，Score 值为 95 和78，自 由 能 分 别 为-20.309999 kCal/Mol、-21.030001 kCal/Mol。其中第一个区域匹配度较高，自由能也较低，结合后稳定性较高(见图 3)。2.4oar-miR-370-5p、oar-miR-665-3p 靶向 TNF 3UTR 基因区域分析经预测，oar-miR-370-5p 和 oar-miR-665-3p 可靶向 TNF 3UTR 基因；oar-miR-370-5p 靶向 TNF 3UTR858-880 区域，其 Score 值为 99，自由能为 22.209999kCal/Mol；oar-miR-665-3p 靶向 TNF 3UTR1214-1236 区域，Score 值为 82，