棉花GhGGB基因的克隆与表达分析_玛迪娜·木拉提.pdf

研究报告Research Report棉花 GhGGB 基因的克隆与表达分析玛迪娜 木拉提孙婷婷代培红王倩胡子曜徐诗佳刘超李月*新疆农业大学农学院,乌鲁木齐,830052*通信作者,摘要蛋白异戊二烯化修饰与植物的抗旱性有关，GGB 作为型香叶酰基转移酶的 亚基参与植物的抗逆途径。本研究以 TM-1 棉花叶片的 cDNA 为模板，PCR 克隆得到 GhGGB 基因，其开放阅读框为 1 131 bp，编码 377 个氨基酸，为亲水性蛋白。此外，通过 RT-qPCR 技术检测和分析了 GhGGB 在不同棉花抗旱品种中根、茎、叶中的表达模式，以及 GhGGB 基因对不同胁迫处理的响应。结果表明 GhGGB 基因在不同抗旱性的棉花品种中无特异性表达；在相同培养条件下，GhGGB 基因受不同胁迫处理后其表达量存在部分差异，其中对干旱处理尤为显著。随干旱胁迫时间的延长，GhGGB 基因的表达量逐渐上升。本研究结果为解析棉花的抗逆分子机制提供了基础。关键词棉花;GGB 基因;蛋白异戊二烯化修饰Cloning and Expression Analysis of GhGGB Gene in CottonMadina MulatiSun TingtingDai PeihongWang QianHu ZiyaoXu ShijiaLiu ChaoLi Yue*College of Agriculture,Xinjiang Agricultural University,Urumqi,830052*Corresponding author,DOI:10.13271 j.mpb.021.000729AbstractProtein isoprene modify related to drought resistance of plant,GGB as geranyl acyltransferase betasubunits also participated in the art way in the plant.In this study,using TM-1 cotton leaf cDNA as template,GhGGB gene was cloned by PCR.Its open reading frame was 1 131 bp,encoding 377 amino acids,and it was a hy-drophilic protein.In addition,RT-qPCR was used to analyze the expression patterns of GhGGB in roots,stems andleaves of different drought-resistant cotton varieties,as well as the response of GhGGB gene to different stresstreatments under the same culture conditions.The results showed that GhGGB gene had no specific expression incotton varieties with different drought resistance.Under the same culture conditions,the expression level of GhG-GB gene was partially different after different stress treatments,especially for drought treatment,and the expres-sion level gradually increased with the extension of drought stress time.The results of this study provide a basis forthe molecular mechanism of stress resistance in cotton.KeywordsCotton;GGB gene;Protein isoprene modification基金项目：本研究由新疆维吾尔自治区创新项目(2019D01A39)资助引用格式：Madina M.L.T.,Dai P.H.,Wang Q.,Hu Z.Y.,Xu S.J.,Liu C.,and Li Y.,2023,Cloning and expression analysis of GhGGBgene in cotton,Fenzi Zhiwu Yuzhong(Molecular Plant Breeding),21(3):729-735.(玛迪娜 木拉提,孙婷婷,代培红,王倩,胡子曜,徐诗佳,刘超,李月,2023,棉花 GhGGB 基因的克隆与表达分析,分子植物育种,21(3):729-735.)棉花是中国最重要经济作物之一，也是中国天然纤维的主要来源，成为了除粮食之外不可或缺的战略储备物资，在国民经济中有着重要的地位(李想,2013;杨毅等,2014)。中国棉花产地主要集中在新疆、黄河及长江流域三个主要产棉区。然而，水资源短缺、土壤盐碱化和频繁的极端气候等生态问题严重影响着棉花的生长环境。此外，棉花在生长发育过程中还会遭受各种病虫害的威胁，这些不利条件已然成为抑制棉花生长发育的重要因素(Sharif et al.,2019;马盼盼等,2021)。植物受外界胁迫时，会启动分子植物育种，2023 年，第 21 卷，第 3 期，第 729-735 页Molecular Plant Breeding,2023,Vol.21,No.3,729-735分子植物育种Molecular Plant Breeding图 1 GhGGB 基因的克隆注:M:Trans 2K Plus DNA Marker;1:GhGGB 基因Figure 1 Cloning of GhGGB geneNote:M:Trans 2K Plus DNA Marker;1:GhGGB gene或关闭体内相关基因来抵御逆境。植物的抗逆是一个复杂的生理生化过程，受多种基因的控制，多数基因都参与了植物的逆境表达，并由特定的顺式作用元件和转录因子与相互作用调控(刘欣和李云,2006)。除了这些正调控基因外，还存在着一些负调控基因，当这些基因发生突变后，其功能会丧失，植物的抗逆性也会随之加强，如 DST(Huang et al.,2009)，ABHl(Hugouvieux et al.,2001),GGB(Johnson et al.,2005)和 ERAl(Pei et al.,1998)等。蛋白异戊二烯化修饰是蛋白翻译后的一类脂类修饰，其底物蛋白的 C 末端最后四个氨基酸一般为CaaX 结构，C 为半胱氨酸，A 为脂肪族氨基酸，X 为丝甲硫氨酸、氨酸半胱氨酸、丙氨酸、亮氨酸或谷氨酸(Caldelari et al.,2001)。蛋白异戊二烯化修饰涉及在法呢基(C15)或香叶酰基(C20)与 C 末端的 CaaX之间形成硫醚键，这种修饰促进着蛋白质与膜、蛋白质与蛋白质之间的相互作用，对蛋白的质膜定位及功能发挥至关重要的作用(Yalovsky et al.,1999)。蛋白异戊二烯化修饰反应由三个异戊烯基转移酶催化完成：型/型蛋白香叶酰基转移酶和蛋白法尼基转移酶(Sinensky,2000)，且型蛋白香叶酰基转移酶与蛋白法尼基转移酶都会组成异源二聚体来发挥功能，两者的 亚基相同，都为 PLP(Sorek et al.,2009)，而 ERA1 和 GGB分别负责编码蛋白法尼基转移酶和型蛋白香叶酰基转移酶的 亚基。研究发现蛋白异戊二烯化修饰与植物的抗旱性有关(John-son and Ingram,2005)。在拟南芥中，plp 突变体使植物体丧失了蛋白异戊二烯化修饰的能力，表现分生组织增大，花器官数增加，生长速度变慢，尤其对脱落酸(ABA)敏感。era1 突变体使植株的分生组织增大，花器官增多，抗旱性明显增强，对生长素诱导侧根的产生及 ABA 表现出敏感(Brady et al.,2003;Crow-ell and Huizinga,2009)。而 GGB 突变后，只在气孔关闭上对 ABA 更敏感，抗旱性也随之增强，且其突变体在表型上与野生型相比无明显差异(Yalovsky et al.,2000;Andrewa et al.,2010)。表明 GGB 基因可能作为一个特异性负调控因子存在于 ABA 信号途径中，在ABA 气孔关闭中起到负调控的作用(Johnson et al.,2005)。通过生物信息学分析发现，棉花基因组中存在一个单拷贝的拟南芥 GGB 的同源基因，为研究棉花GGB 基因是否与拟南芥 GGB 基因的功能相符，本研究以陆地棉 TM-1 棉花叶片的 cDNA 为模板，克隆得到了 GhGGB 基因的目的片段，再利用 Expasy、ProtComp-Version9.0 等在线软件对其进行生物信息学分析，且为探究 GGB 基因是否还受不同品种，高盐，低温和黄萎病菌等因素的影响，通过实时荧光定量 PCR 技术对 GhGGB 基因在不同抗旱性棉花品种中和不同胁迫处理下的表达量做了分析，本研究为进一步探究棉花抗逆性机制提供参考。1结果与分析1.1 GhGGB基因克隆与序列分析以陆地棉 TM-1 叶片 cDNA 为模板进行 PCR扩增，结果所示(图 1)，扩增片段大小符合预期，表明已克隆出 GhGGB 基因的 CDS 序列(GenBank No.MK105923)。利用在线软件对 GhGGB 基因的序列分析可知，其开放阅读框长度为 1 131 bp，编码 377 个氨基酸，相对分子量为 42.13 kD，等电点为 5.09，为亲水性蛋白。信号肽预测分析结果显示 GhGGB 蛋白没有信号肽，亚细胞定位发现其表达的蛋白定位在细胞质(表 1)。随后通过 MegAlign 软件对棉花GhGGB 蛋白和拟南芥 AtGGB 蛋白进行相似性分析发现，它们之间有 68.9%的相似性。1.2 GhGGB基因在不同抗旱性棉花品种中的表达分析为分析 GhGGB 基因在不同抗旱性棉花及其不同组织中的表达模式，提取了 新陆早 22 等 12 种棉花的根、茎、叶总 RNA，以 UBQ7 为内部参照，进行了目的基因的 RT-qPCR 分析。结果显示(图 2)，在所有检测的棉花的根、茎、叶组织中，GhGGB 基因在茎部的总体表达量均高于叶与根部组织的表达量，且不同品种间各组织部位的表达量存在显著差异，但无特异性的表达。通过对不同抗旱性棉花叶片组织中 GhGGB 基因表达量的分析可知，在 中棉 35 品730表 1 棉花 GhGGB 基因生物信息学分析Table 1 Bioinformatics Analysis of GhGGB gene in cotton基因GeneGhGGBORF(bp)1 131氨基酸Amino acid377相对分子质量(kD)Relative molecularquality(kD)42.13理论等电点Theoreticalisoelectric point5.09平均疏水性Averagehydrophobicity-0.098信号肽Signal peptide无No亚细胞定位Subcellularlocalization细胞质Cytoplasm脂肪系数Fat coefficient86.97棉花 GhGGB 基因的克隆与表达分析Cloning and Expression Analysis of GhGGB Gene in Cotton种中其表达量达到最高，在 PIMA 品种中表达量最低，两者之间存在显著差异(图 2A)；通过对不同抗旱性棉花根部组织中 GhGGB 基因的表达量的分析可知，在 3904 品种中其表达量最高