密蒙花、降香混合醇提物脂质体的制备工艺优化及质量评价_李玉姗.pdf

过程中化学成分含量降低，而化学成分是中药发挥药效作用的物质基础，药效作用的强弱与其活性成分含量密切相关所致。本文首先从宏观角度采用色差仪量化大黄颜色，其次从化学成分角度出发阐明大黄药效差异的根本因素，旨在初步了解大黄在干燥加工过程中的化学成分及药理作用的动态变化。参考文献：王 玉，杨 雪，夏鹏飞，等 大黄化学成分、药理作用研究进展及质量标志物的预测分析 中草药，（）：王亦君，冯舒涵，程锦堂，等 大黄蒽醌类化学成分和药理作用研究进展 中国实验方剂学杂志，（）：金丽霞，金丽军，栾仲秋，等 大黄的化学成分和药理研究进展 中医药信息，（）：丁长海，陈敏珠，魏 伟，等 抗氧自由基药物研究进展 中国药理学通报，（）：余 丹，陈代文 活性氧自由基对动物健康及饲料质量的影响 饲料广角，（）：张绪超，赵 力，陈 懿，等 环境持久性自由基及其介导的生物学损伤 中国环境科学，（）：李秋颖，虞夏晖，毛明江，等 含蒽醌类成分中药的体外抗氧化活性与蒽醌含量相关性分析 中华中医药杂志，（）：王宇卿，李淑娇，姜旭 在线检测大黄抗氧化活性成分 中国医院药学杂志，（）：李 芸，苗小楼，吴平安，等 不同产地加工方法对掌叶大黄药材质量的影响 中药材，（）：潘晓静 紫外分光光度计的发展趋势探析 科技与创新，（）：徐曼菲，吴志生，刘晓娜，等 从辨色论质谈中药质量评价方法 中国中药杂志，（）：黄思雨 绿茶、桑叶和臭黄荆叶细粉抗氧化、抗炎及肠道益生性探究 西南大学硕士学位论文，陈 星 山楂多糖的提取纯化、表征及其体外抗氧化活性研究 淮阴工学院硕士学位论文，李 倩，艾青青，兰志琼，等 大黄药材贮藏期间质量及药理作用变化研究 中药与临床，（）：高代夏 大黄 种炮制品提取物的泻下作用异同对比评价 北方药学，（）：黄晓红 不同炮制方法对大黄泻下 解热 抗炎作用的影响研究 现代医药卫生，（）：马 丹，郭 玫，王志旺，等 三种人工栽培大黄的泻下作用比较研究 中国应用生理学杂志，（）：王 梅，陈俊荣，宋翠荣，等 酒大黄的镇痛抗炎作用 中国实验方剂学杂志，（）：何凌仙子，贾志清，刘 涛，等 植物适应逆境胁迫研究进展世界林业研究，（）：收稿日期：；修订日期：基金项目：国家中药材产业技术体系专项资金（）；黑龙江省自然科学基金资助项目（上）作者简介：李玉姗（），女（汉族），河南南阳人，黑龙江省中医药科学院中药研究所在读硕士研究生，学士学位，主要从事中药分析及药效物质基础研究工作通讯作者简介：王伟明（），女（汉族），黑龙江哈尔滨人，黑龙江省中医药科学院中药研究所研究员，博士研究生导师，博士学位，主要从事中药新药研发工作密蒙花、降香混合醇提物脂质体的制备工艺优化及质量评价李玉姗，李梦雪，刘华石，霍金海，王伟明（黑龙江省中医药科学院中药研究所，黑龙江 哈尔滨）摘要：目的 为增加密蒙花、降香混合提取物的溶解度，提高生物利用度；制备含有密蒙花、降香混合提取物的脂质体，评价其 自由基清除能力。方法 采用高速离心法测定脂质体的包封率；以外观性状、包封率和稳定性为评价指标，从薄膜超声法、乙醇注入法和熔融法中筛选脂质体的最佳制备方法；通过单因素实验考察大豆卵磷脂与胆固醇的质量比、大豆卵磷脂与胆固醇的总量、旋蒸温度、中药提取物冻干粉的用量等影响脂质体包封率的因素；进一步采用正交组合设计试验筛选出脂质体的最佳制备工艺参数，并从粒径、电位、包封率、稳定性、抗氧化能力方面对所制备的脂质体进行质量评价。结果 采用薄膜超声法所制备的脂质体的包封率最佳，正交试验结果显示大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为、大豆卵磷脂与胆固醇的总量为、旋蒸温度、中药提取物冻干粉的用量；最佳工艺制备的脂质体呈椭圆形，平均粒径为 ，电位为 ，最佳工艺制备脂质体的包封率为 ，稳定性良好；脂质体的 自由基清除能力高于维生素，与其质量浓度呈正相关。结论 以薄膜超声法作为制备的脂质体的最佳方法，且粒径小、分散性好，具有良好的稳定性和抗氧化功能。关键词：降香；密蒙花；脂质体；薄膜分散法；包封率；抗氧化 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（）密蒙花为马钱科植物密蒙花 的干燥花蕾和花序。主要含黄酮类、苯乙醇苷类等成分，其中黄酮类成分具有抗炎、降糖、抗氧化等功效，以蒙花苷含量最高，其临床应用多集中于眼部疾病的治疗，对于抗氧化的应用，研究较少。苯乙醇苷类成分具有抗氧化、免疫调节等作用，其中毛蕊花糖苷的含量最高，。降香是豆科植物降香檀 的树干以及根的干燥心材。目前降香化学成分的研究以挥发油成分为主，但已有相关研究证明降香黄酮类化合物具有抗炎、抗氧化等活性，且含量较为丰富，具有较大的开发利用潜力。其中降香中的柚皮素和甘草素可以降低 的释放，除此之外降香的乙醇提取物具有预防皮肤光老化的作用，因此，降香在抗氧化和预防光老化方向具有很大的开发潜力。时珍国医国药 年第 卷第 期 降香和密蒙花在天然抗氧化剂开发中具有一定发展前景，但降香中的柚皮素和密蒙花中的蒙花苷的水溶性和脂溶性均较差，制备成传统剂型会出现稳定性差、药物吸收不完全，生物利用度低等问题，从而限制了其在医药和食品等行业的应用。脂质体是由磷脂双分子层膜所形成的囊泡，将药物包裹在双分子中或是囊泡中。其包覆技术可以增强其生物利用度，同时提高药物的稳定性和透皮吸收率。同时可以降低药物的刺激性，避免了氧化和光不稳定性。脂质体因其较小的粒径，在经皮给药方面具有较好的应用前景，可广泛地应用于医药及化妆品等领域。本实验以密蒙花、降香的醇提物为研究对象，以大豆卵磷脂和胆固醇为膜材，分别考察了薄膜超声法、乙醇注入法和融溶法三种脂质体的制备方法，并对脂质体制备条件进行单因素考察；采用正交实验设计筛选出脂质体的最佳制备工艺参数；同时对脂质体进行质量评价，考察脂质体 自由基清除率，评价抗氧化能力。材料与仪器 材材料料 中药提取物冻干粉（为密蒙花和降香的醇提物经超低温冻干混合制得，实验室自制）；大豆卵磷脂（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：）；胆固醇（上海麦克林生化科技有限公司，批号：）；甘草素（成都瑞芬思科技公司 纯度）；毛蕊花糖苷（成都瑞芬思科技公司 批号：纯度）；蒙花苷（成都埃法生物生物科技有限公司 批号：纯度）；柚皮素（北京中检航标批号：纯度）；，二苯基 三硝基苯肼（北京博奥拓达科技有限公司 纯度）；无水乙醇（西陇科学有限公司）；仪仪器器 紫外分光光度计（美国 公司）、超纯水机（美国艾科浦公司）、电子天平（北京赛多利斯科学仪器公司）、旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）、型低温高速离心机（美国 公司）、透射电子显微镜（日本日立公司）、型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、激光粒径分析仪（奥地利 公司）。方法 脂脂质质体体制制备备方方法法的的筛筛选选 薄薄膜膜超超声声法法 精密称取大豆卵磷脂 、胆固醇 、中药提取物冻干粉 于烧杯内，加入 无水乙醇溶液，混合均匀后超声溶解。转移到 圆底烧瓶中于旋转蒸发仪上 减压蒸发约 ，除去乙醇；待形成脂质膜后，再加入 纯化水（含 吐温）旋转水化约 ，使其充分水合后，在冰水浴中超声处理（超声时间 ，超声功率），即为载药脂质体。乙乙醇醇注注入入法法 精密称取大豆卵磷脂 、胆固醇 、中药提取物冻干粉 于烧杯内，加入 无水乙醇溶液，磁力搅拌至完全溶解，用微量注射器将混合溶液匀速缓慢的注入到 纯化水（含 吐温 ）中，维持恒温 ，并不断地磁力搅拌除去乙醇，使其充分水化，然后转移到 圆底烧瓶中于旋转蒸发仪上 减压蒸发除去乙醇，最后对得到的脂质体混悬液，于冰浴中超声处理（超声时间 ，超声功率为），即为载药脂质体。熔熔融融法法 精密称取大豆卵磷脂 、胆固醇 于烧杯内，加入 无水乙醇溶液，磁力搅拌至完全溶解，于水浴上蒸干，加入 纯化水（含 吐温 ）搅拌形成熔融状态。称取中药提取物冻干粉 溶解在适量的乙醇溶液中，加入上面的熔融体系中，恒温搅拌 后，于冰浴中超声处理（超声时间 ，超声功率 ），即为载药脂质体。上述 种制备方法所制备的样品分别平行 次，确保实验结果的可靠性，以外观性状和包封率为评价指标，筛选最佳制备方法。中中药药脂脂质质体体处处方方和和制制备备工工艺艺优优化化 单单因因素素试试验验 大大豆豆卵卵磷磷脂脂 胆胆固固醇醇质质量量比比对对脂脂质质体体包包封封率率的的影影响响固定大豆卵磷脂 胆固醇总量为 ，中药提取物冻干粉添加量为 ，旋蒸温度为 不变；使大豆卵磷脂与胆固醇的质量比分别为、制备脂质体，以包封率为主要评价指标，考察大豆卵磷脂 胆固醇质量比对脂质体包封率的影响。大大豆豆卵卵磷磷脂脂 胆胆固固醇醇总总量量对对脂脂质质体体包包封封率率的的影影响响 固定大豆卵磷脂 胆固醇质量比为，中药提取物冻干粉添加量为 ，旋蒸温度为 不变；使大豆卵磷脂与胆固醇的总量分别为，制备脂质体，以包封率为主要评价指标，考察大豆卵磷脂 胆固醇总量对脂质体包封率的影响。中中药药提提取取物物冻冻干干粉粉添添加加量量对对脂脂质质体体包包封封率率的的影影响响 固定大豆卵磷脂 胆固醇质量比为，大豆卵磷脂 胆固醇总量为，旋蒸温度为 不变；使中药提取物冻干粉的添加量分别为，制备脂质体，以包封率为主要评价指标，考察中药提取物冻干粉的添加量对脂质体包封率的影响。旋旋蒸蒸温温度度对对脂脂质质体体包包封封率率的的影影响响 固定大豆卵磷脂 胆固醇质量比为 ，大豆卵磷脂 胆固醇总量为，中药提取物冻干粉添加量为；使旋蒸温度分别为、制备脂质体，以包封率为主要评价指标，考察旋蒸温度对脂质体包封率的影响。正正交交试试验验 为优化脂质体的处方工艺，在单因素考察结果的基础上选择大豆卵磷脂与胆固醇的比例（）、大豆卵磷脂与胆固醇的总量（）、旋蒸温度（）、中药提取物冻干粉的用量（）个考察因素为衡量指标，每个主要因素选取 个不同水平，以包封率作为主要考察指标，进行（）正交试验，对中药脂质体处方进行筛选优化。因素水平设计如表 所示。表 中药脂质体处方筛选正交试验因素水平水平 验验证证实实验验 根据正交实验中最佳组合配方制备中药脂质体，平行 次，并测定其包封率，进而评价该配方的重现性。中中药药脂脂质质体体的的质质量量评评价价 中中药药脂脂质质体体的的外外观观形形态态 吸取最佳处方工艺制备的中药脂质体样品 ，用超纯水稀释 倍后，混匀后，取 滴于铜网上，静置 ，再滴加 磷钨酸溶液负染 ，用滤纸吸去多余染色液，自然晾干，用透射电子显微镜观察形态并拍摄照片。中中药药脂脂质质体体粒粒径径、电电位位的的测测定定 吸取最佳处方工艺制备的中药脂质体样品适量，用纯化水稀释 倍后，混合均匀后，采用激光粒度分析仪测定其粒径、电位。中中药药脂脂质质体体包包封封率率的的测测定定 最最大大波波长长的的确确定定 精密称取中药提取物冻干粉 至 容量瓶内，乙醇溶解并定容至刻度；另分别取甘草素、柚皮素、毛蕊花糖苷和蒙花苷适量，乙醇溶解配制成标准品溶液，以乙醇溶液作为空白对照，采用紫外分光光度计在 范围内对上述样品溶液及标准溶液进行紫外扫描，测定最大吸收波长。标标准准曲曲线线的的建建立立 称取甘草素对照品 ，置 容量瓶中，加乙醇溶解并定容至刻度；精密吸取 ，时珍国医国药 年第 卷第 期，分别置于 量瓶中，用乙醇稀释至刻度，于 处进行紫外扫描，以吸光度为纵坐标，甘草素浓度为横坐标，绘制标准曲线。包包封封率率的的测测定定 采用高速离心法测定载药脂质体中游离成分的含量，取 中药脂质体，在温度 、离心机转速 条件下离心，取 上清液，加入无水乙醇溶液进行破乳，然后用无水乙醇定容至 ，在紫外分光光度计中测定其在 处的吸光度值；另取 中药脂质体，直接用无水乙醇定容至 ，同样测定其在 处的吸光度值；根据标准曲线回归方程分别得 总和 游。（）（总 游）总 其中：总 被包封的总体药物的量游 游离的药物的量 稳稳定定性性和和渗渗漏漏率率的的测测定定 取 份中药脂质体混悬液，分别于 、三种温度条件下放置 天，分别在第、依次取样观察外观性状，并于 离心，测量包封率的变化，并计算渗漏率。渗漏率（）起始时 储藏一定时间后 起始时其中：起始时 载药脂质体在第一次测定时的包封率储藏一定时间后 载药脂质体在规定日期测定的包封率 中中药药脂脂