牦牛SMAD1基因第1外显...检测及与生长性状的关联分析_周建强.pdf

西 北 农 业 学 报 ，（）：牦牛 基因第外显子 检测及与生长性状的关联分析收稿日期：修回日期：基金项目：国家自然科学基金（）；青海省科技项目（，）。第一作者：周建强，男，硕士研究生，从事草食动物生产与改良研究。：通信作者：刘秀，男，副研究员，主要从事草食动物生物技术及遗传育种研究。：孙永刚，男，副研究员，主要从事动物遗传育种与繁殖研究。：周建强，司思，祁增源，韩银仓，刘秀，孙永刚（甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃省草食动物生物技术重点实验室，兰州 ；青海省畜牧兽医科学院，西宁 ）摘要研究牦牛 基因第外显子 与生长性状的关系，寻找与牦牛生长性状相关的分子标记。采用 测序和单倍型分型技术，对青海牦牛 基因进行 检测及其基因分型、连锁不平衡和单倍型分析，并对多 态 位点 的基因型 及组合单 倍 型 与 牦 牛 生 长 性 状 的 关 联性进行分析。结 果 发 现，在第外显子上存在个突变位点，其中，、和 均存在种基因型，和 均存在种基因型。连锁不平衡分析发现个位点间不存在强的连锁不平衡效应，单倍型分析发现存在种不同的单倍型，其中单倍型 的发生频率最高。关联性分析表明，位点与胸围显 著 相 关，位 点 与 体 斜 长、胸 围 显著相关，和 位点与体质量、体高、体斜长和胸围显著相关，位点与胸围、体高显著相关。通过基因型组合发现，种组合单倍型均与牦牛生长性状有着显著或极显著相关，且 可能是影响牦牛生长性状的最优组合单倍型。综上所述，牦牛 基因第外显子多态性丰富，且与部分生长性状显著关联，可作为牦牛分子标记辅助选择的候选基因。关键词牦牛；基因；单倍型；生长性状牦牛主要分布在青藏高原及其毗邻的高山和亚高山地区，是典型的放牧家畜。牦牛是中国稀有而珍贵的遗传资源，中国牦牛总量约 万头，占世界牦牛总量的 以上。牦牛生长缓慢、饲养条件粗放、生产性能低下，使得其经济效益和生产效率较低。蛋 白 家 族 是 将 转 化 生 长 因 子（，）超家族成员包括 、以及骨形态发生蛋白（，）、活化素等多个成员的信号传导至细胞核的介导蛋白。在调节细胞生长、增殖、分化、迁移和凋亡中起重要作用，可参与器官和组织的生长发育过程。目前，蛋白已发现至少有种（），其 中，、是 受 体 激 活 型 蛋 白（，）；是通用 调 节 型 蛋 白（，）；和 是抑制 型 蛋 白（，）。研究表明，的生物学作用几乎涉及机体所有系统，其不只限于调控骨骼的形成和发育，并且在动物的生长发育过程中起着重要作用。、能被 受体磷酸化，参与信号的传导，进而调控动物的生长发育。研究发现，在鼠的骨骼肌细胞核中定位并敲除 、基因后，其肌肉量减少。对鼠胚胎干细胞（）进行分析，发现 、和 占据一组生长调节因子，而这组调节因子的功能是促进 快速分化。研究发现，、通 路 能 与 、通 路 竞 争 ，从 而 提 高 肌 肉 量 及 促 进 成 肌 分 化 过程。同时，关于 基因的研究多集中在小鼠、大鼠、人类及其在一些疾病方面的作用，而 基因与牦牛生长发育及生长性状的关联性则鲜有报道。因此，本研究将牦牛 基因作为候选基因，采用 测序和单倍型分型技术，对青海牦牛 基因第外显子进行 检测，寻找与牦牛生长性状相关的 位点，以期为牦牛分子育种以及 基因的功能研究提供理论基础。材料与方法 试验材料在青海省海北州祁连县野牛沟乡边麻梅龙掌合作社随机选择成年（岁）健康高原型母牦牛 头，颈静脉采血 ，抗凝（血液），轻微摇动混匀样品后置于 保存，备用。同时测量记录牦牛的体质量、体斜长、体高、胸围和管围个体尺指标。基因组 提取及检测根据血液 提取试剂盒（天根，北京）的方法从血液中提取基因组 。用超微量分光光度 计（）检 测 的 浓 度，用琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 的 完 整 性，保存，备用。引物设计和 扩增在 中 查 询 牦 牛 （）的 基 因 序 列，设 计 引 物（用 软件）。引物信息见表（由上海生工生物工程有限公司合成）。反应体系 ：上游、下游引物各（）、（内含 聚合酶、等）、模板（），加 。反应参 数：预 变 性 ；变 性，退火，延伸，个循环；延伸 ；保存。表引物序列信息 基因 引物序列（）片段长度 退火温度 扩增区域 ：第一外显子 检测 扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。将扩增质量较好的 产物送至上海生工生物工程有限公司进行纯化测序。使用 软件对测序结果进行对比分析，寻找 位点。数据统计分析利用 进行基因型统计，分析计算遗传多态性，包括基因型、等位基因频率、遗传杂合度（）、有效等位基因数（）和多态信息含量（），并对 基因多态性位点在牦牛群体中的基因型分布进行卡方检验。采用 软件中一般线性模型分析 位点与生长性状的关联性。对 基因个 位点进行连锁不平衡、单倍型分析（使用 软件）。分析基因型效应对生长性状的影响。采用固定模型：式中，为个体表型值；为群体均值；为标记基因型效应；为随机误差。结果与分析 基因 的遗传特征分析测序分析发现，牦牛 基因第外显子存在个 位点（图），分别是 、和 ；和 均存在 和 种基因型；存在 、和 种基因型；存在、和 种基因型；存在 和 种基因型。牦牛 基因第外显子遗传多态性分析结果见表，在 上的 和 的优势基因型均是，优势等位基因均是；和 的优势基因型均是，优势等位基因均是；突变位点的优势基因型是 ，优势等位基因是。卡方检验表明 、和 个突变位点均处于 平 衡 状 态（），西北农业学报 卷 ；图 基因个位点基因型测序图 表牦牛 基因遗传多态性分析 位点 基因型频率 等位基因频率 卡方检验多态信息含量 杂合度 有效等位基因 （）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）注：为高度多态；为中度多态；为低度多态，。：，期周建强等：牦牛 基因第外显子 检测及与生长性状的关联分析 和 处于极不平衡状态（）；、和 处于低度多态水平（），和 处于中度多态水平（）；个 位 点 杂 合 度 中 杂合度最大，最小；有效等位基因数均大于，且 最大，最小。牦牛 基因突变位点基因型对生长性状的影响由表可知，位点与胸围显著相关，基因型个体的胸围极显著大于 基因型个体（），其他指标差异不显著（）；位点与体斜长、胸围显著相关，基因型个体的体斜长和胸围极显著大于 基因型个体（），其他指标差异不显著（）；和 位点与体质量、体高、体斜长和胸围显著相关，其中，位点基因型和基因型个体的体质量、体高、体斜长和胸围均极显著大于 基因型个体（），位点 基因型个体的体质量、体高、体斜长和胸围均极显著大于 基因型个体（），其他指标差异不显著（）；位点与胸围、体高显著相关，基因型个体的体高显著大于 基因型个体（），胸围极显著大于 基因型个体（），其他指标差异不显著（）。表 第外显子个突变位点与牦牛生长性状的关联性分析 位点 基因型 体质量 体高 体斜长 胸围 管围 （）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）注：数值为“平均数标准差”。同位点不同基因型间不同小写字母表示差异显著（），不同大写字母表示差异极显著（）。：“”（），（）基因 位点的单倍型和连锁不平衡分析对 基因上个 位点进行单倍型分析，将发生频率低于 的单倍型剔除，检测到种单倍型，分别为 （表）。其中单倍型 的发生频率最高为 ，是主要单 倍 型，单 倍 型 的 发 生 频 率 最 低 为 。通过表得出，基因各个位点间不存在强的连锁不平衡效应，个 位点两两间的 ，（，时为强连锁不平衡）。基因 位点组合单倍型对牦牛生长性状的影响软件分析发现，基因中个 位点共 有种 组 合 单 倍 型，将 发 生 频 率 低 于 的种组合单倍型定义为其他类型，并剔除，将其余的组合单倍型与牦牛的生长性状进行关联性分析。由表得出，组合单倍型 的个体均值在体质量、体高、体斜长、胸围和管围指标均极显著高于 、和 组合单倍型的个体均值（）。综上可得，组合单西北农业学报 卷倍型 可能是影响牦牛生长性状的最优组合单倍型。表牦牛 基因突变位点单倍型分析 单倍型 频率 表牦牛 基因突变位点连锁不平衡分析 位点 表 基因突变位点组合单倍型与牦牛生长性状关联性分析 组合单倍型（个数）（）体质量 体高 体斜长 胸围 管围 （）（）（）（）注：同列不同小写字母表示差异显著（），不同大写字母表示差异极显著（）。：（），（）讨 论生长性状是衡量家畜个体生长发育和经济效益的一个重要指标，在育种学中具有重要的价值。将基因多态性与生长性状联系起来，选育出生长发育快的个体，可以有效缩短对生长性状的选育年限。不仅在促进骨骼形成方面有重要作 用，且 对 激 素 分 泌 和 生 长 也 有 重 要 作用。研究表明，参与 信号通路来调控成年肌肉量变化，并对成肌因子和分化过程有重要作用，。钟昕 和王鑫磊 发 现基因的多态性与黄牛的生长性状有较大的关联性。所以，推测 基因与生长性状有一定的关联。基因在家畜中的研 究较少。宁越等 证实 基因可正向调控秦川牛原代成肌 细 胞 分 化。池 秋 蝶 等 研 究 发 现 文 蛤 基因多态性与文蛤的生长性状显著相关。本试验采用 直接测序法进行基因型分型，在牦牛 基因第外显子上发现个突变位点，根据卡方检验可看出 、和 个突变位点均处于 平衡状态（），可知，在有突变的情况下，经自然选择、人为选育的干扰，最终各种因素相互抵消，使得群体处于遗传动态平衡状态；和 处于极不平衡状态（），可能是环境或者人为因素影响。对于群体而言，多态信息含量期周建强等：牦牛 基因第外显子 检测及与生长性状的关联分析高、杂合度大、有效等位基因数目多，则该位点的遗传变异性就高，说明其有较大的选择潜力。、和 杂合度小，有效等位基因数目少且处于低度多态（），说明这个位点多态性较少且选择潜力较小；和 杂合度大，有效等位基因数目多且处于中度多态（），说明这两个位点多态性较丰富且选择潜力较大。连锁不平衡分析发现个位点间均不存在强的连锁不平衡，单倍型分析发现种不同的单倍型，其中单倍型 的发生频率最高。关联性分析得出，牦牛 基因的个位点均与部分体尺指标显著相关，且均与胸围指标有显著相关，可能与 在促进骨骼形成方面有重要作用有关。此外，研究发现不仅单个 会影响动物的表型，而且组合效应也会影响动物的表型。李爱民等 研究发现 基因个 之间的组合均与鲁西牛生长 性 状 显 著 相 关。徐 怀 超 等 研 究 发 现 基因不同组合单倍型与秦川牛生长性状有显著关联。本试验将 基因中的种组合单倍型与牦牛生长性状进行关联性分析得出，种组合单倍型均与牦牛生长性状有着极显著和显著的关系，且组合单倍型 可能是影响牦牛生长性状的最优组合单倍型。结 论 基因在牦牛中存在多态性，且发现的个位点均与生长性状显著关联，优势单倍型组合是 。所以，可以将 作为分子标记辅助选择的候选基因，应用在牦牛分子标记辅助育 种 中，缩 短 育 种 周 期，加 快 牦 牛 产 业 的发展。参考文献 ：孟庆辉，陈永杏，董红敏，等牦牛分布特点及其种群数量家畜生态学报，（）：，（）：闫晓晶，雷元华，谢鹏，等牦牛肉干制品加工研究进展肉类研究，（）：，（）：周立业 不同饲养方式对放牧犊牦牛生长发育及肉品品质的影响 兰州：甘肃农业大学，：，（）：，（）：王今越转化生长因子信号与肌肉调控中国组织工程研究，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：艾锦新黔北麻羊、基因甲基化与生长性状的遗传效应研究贵阳：贵州大学，：，陈兵，易斌，鲁开智 蛋白家族调控细胞分化的研究进展医学研究生学报，（）：，（）：，：，（）：王铁岗动物遗传育种基础北京：化学工业出版社，：，：，（）：苟海昕，詹红生，赵咏芳，等补肾中药对自然衰老雄性大西北农业学报 卷鼠骨髓微环境中 基因表达的影响中国中医骨伤科杂志，（）：，（）：，：，（）：钟昕 黄牛、及 基因的多态性检测及其与体尺性状的关联分析陕西杨凌：西北农林科技大学，：，王鑫磊黄牛 、基因多态性及其与生长性状的关联分析 陕西杨凌：西北农林科技大学，：，宁越，米雪，陈星伊，等 基因的沉默和过表达及对秦川牛原代成肌细胞生肌的影响 中国农业科学，（）：，（）：池秋蝶，董迎辉，姚韩韩，等文蛤 基因克隆、时空表达及