蒙古韭叶绿体微卫星特征分析_王宏霞.pdf

书书书北方园艺 （）：研究论文第一作者简介：王宏霞（），女，博士，副教授，现主要从事蔬菜分子植物育种等研究工作。：基金项目：青海省自然科学基金资助项目（）。收稿日期：蒙古韭叶绿体微卫星特征分析王 宏 霞，李 文 麒（青海民族大学 生态环境与资源学院，青海 西宁 ；青海省特色经济植物高值化利用重点实验室，青海 西宁 ；生物技术与分析测试实验室，青海 西宁 ）摘要：以蒙古韭为试材，采用 高通量测序技术对叶绿体基因组进行测序，软件对叶绿体基因组微卫星进行搜索，研究了蒙古韭叶绿体微卫星特征，以期为蒙古韭的鉴定、居群遗传学研究和系统发育研究提供参考依据。结果表明：在蒙古韭 的叶绿体全基因组序列上共识别出 个 位点，平均每 出现一个，主要分布于大拷贝区。重复序列共有种类型，其中单碱基重复序列最多，为 个，约占重复序列总量的 ，其次是三碱基重复序列，共 个，约占重复序列总量的 ，五碱基最少，仅占 。长度区间为 ，从整体来看，主要集中在 ，在该范围内共有 个，占 总数的 ；长度 的有个，结果表明蒙古韭叶绿体基因组上的微卫星位点大多数具有多态性的潜能。关键词：蒙古韭；叶绿体；微卫星中图分类号：文献标识码：文章编号：（）蒙古韭（）属百合科葱属多年生鳞茎丛生草本植物，别名沙葱。蒙古韭在中国的分布区约在北纬 ，东经 ，包括陕西、甘肃、宁夏、内蒙古、新疆、青海省（区），主要分布在荒漠草原及沙漠地区的砂地、低山丘陵地、沙漠边缘、干旱的山坡和河床上。蒙古韭地上部入蒙药能开胃、消食、杀虫等，所以蒙古韭作为一种山野菜具有极高的营养价值和药用价值，同时也是荒漠区马、牛、羊等抓膘促肥的优质牧草，此外蒙古韭极强的适应性对于荒漠区生态系统植被恢复与重建具有重要意义，因而还有较高的生态价值。目前国内外关于蒙古韭的研究主要为营养成分，解剖结构，遗传多样性，不同条件对蒙古韭种子萌发的影响，但对叶绿体微卫星研究尚鲜见相关报道。叶绿 体 微 卫 星（，），是研究叶绿体 的一种分子标记，其既具有微卫星标记的优点又兼顾到叶绿体基因组的特点，目前主要用于植物群体遗传多样性和遗传 结 构 分 析、系 统 发 育 研 究 等 方 面。王越 利用叶绿体 序列和 内含子基因对 种葱属植物与几种外类群萱草属植物进行了亲缘关系的分析表明，葱属与外类群系统树明显分开，进一步支持葱属植物为单系起源这一观点。郭元元 等 利 用 转 录 组 序 列 对 香 葱 进 行 标记开发，为香葱遗传多样性分析、种质资源鉴定提供充足可靠的标记来源。田保华等 利用叶绿体 序列对 种葱属植物进行系统发育分析结果表明，洋葱、分蘖洋葱和胡葱亲缘关系最近，大葱、鸡腿葱和阿尔泰葱之间也非常近。但是，至今对蒙古韭叶绿体微卫星的研究还鲜有相关报道。基于此，该研究通过获取蒙古韭的叶绿体基因组的完整序列，并对蒙古韭叶绿体微卫星的序列组成、分布等特征进行分析，以期为蒙古韭的群体遗传多样性、品种鉴定、序列引物设计等研究提供基础信息。材料与方法 试验材料供试材料蒙古韭采集于青海省共和县（北纬 ，东经 ，海拔 ）。试验方法 叶绿体基因组序列的获取利用 法对样本材料进行 的提取，经琼脂糖凝胶电泳进行检测，合格后的 用超声波将其片段化，经过末端修复、端加、接头连接和 扩增等步骤构建文库，质检合格的文库在南京集思慧远生物科技有限公司的 测序平台上进行测序。原始数 据 通 过 去 除 低 质 量 的 ，得 到 ，之后使用 比对叶绿体基因组数 据 库，得 到 测 序 序 列。随 后 用 软件 进行序列组装、使用 进 行 组 装 完 成 后 的 质 控，通 过 注释获得完整叶绿体基因组序列，并人工校正，最后在 数据库中上传经过注释的蒙古韭叶绿体基因组，登录号为 。叶绿体微卫星分析方法使用软件 对微卫星序列进行识别和定位，设置标准如下：单核苷酸的重复次数在次以上，二核苷酸的重复在次以上，个核苷酸的重复次数在次以上。数据分析采用 软件统计微卫星分布区域，形成微卫星特征表格；基于微卫星碱基类型，分别统计不同重复类型的微卫星序列长度和个数，采用 设计其数量、比例、丰度等信息，形成不同重复碱基类型表格。结果与分析 蒙古韭叶绿体基因组特征蒙古韭叶绿体基因组序列总长度为 ，是典型的环状四分体结构，这与大多数高等植物一致。其中包含一个大单拷贝区（，），长度为 ；一个小单拷贝区（，），长度为 ；以及对 反 向 重 复 区（，），长度为 （图）。含量为图蒙古韭叶绿体基因组图谱 .北方园艺月月（上上），其中 区、区和 区的 含量分别为 、和 。蒙古韭叶绿体基因组共编码 个基因，包括 个 基因、个 基因以及 个编码蛋白基因，其长度和结构与葱属的其它物种相近（表）。蒙古韭 基 因 组 数 据 已 上 传 至 ，登 录 号为 。蒙古韭 分布利用 软件对蒙古韭叶绿体基因组进行简单重复序列（）位点检索，在总长为 的基因组中共检测到 个 （含复合型 ），若不考虑复合型 的存在，则 位点共有 个，占总基因组的 ，序列的总长度为 ；位点的平均分布距离为 。序列在蒙古韭叶绿体基因组的 均有分布，分布范围较广，其中有 个 分布于大拷贝区，数量占比最高（），在小拷贝区和个反向重复序列上分别有 个和 个 位点（表）。表种葱属植物叶绿体基因组的基本特征比较 基因特征 蒙古韭.藠头.大花韭.粗根韭.基因组长度 大单拷贝区 小单拷贝区 反向重复区 基因数量 数量 基因数量 基因数量 表蒙古韭 分布特征 .分布区域 位点数量 占比 反向重复区 大拷贝区 小拷贝区 重复碱基组成与丰度分析蒙古韭 中，重复类型共种，其中单碱基重复序列最多，为 个，约占重复序列总量的 。在单碱基重复序列中以 数量最多，为 个，类型内百分比为 。其次是三碱基重复序列，共 个，约占重复序列总量的 ，其 中 三 碱 基 重 复 序 列 中 以 数 量 最 多，共 有 个，类 型 内 百 分 比 为 。再次是二碱基重复序列共 个，约占 ，其中有个重复序列为 ，其它的为 或 重复。四碱基重复序列有 个，数量最多，共个，类型内百分比为 ，其它类型各有个。五碱基重复序列仅有种，出现次，类型内百分比为 。各类型重复序列中，单碱基重复序列的丰度最高，为 个（表）。蒙古韭 长度与基序拷贝数分布蒙古韭叶绿体基因组的 重复长度区间为 ，平均长度为 ，从整体来看，的重复长度绝大部分分布在 ，共有 个（占总 的 ）；长度大于 （包括 ）的有个，占 。在所有的 中，长度为 的 共有 个，数量最多，占 ；数 量 次 之 的 长 度 为、，它们的分布情况分别为 个（）、个（）、个（）、个（）（图）。在蒙古韭叶绿体基因组序列中，的基序拷 贝 数 集 中 在，其 中 拷 贝 数 为 的 数量最多，占 ；在单碱基重复序列中，拷贝数为 的重复序列占总数的 ，仅有第第期期 北方园艺表不同重复类型的分布特征 重复类型 基序 含该基序的 数量 类型内百分比 丰度 （个）单碱基 二碱基 三碱基 四碱基 五碱基 图微卫星长度分布 个；在三碱基重复序列中拷贝数为的序列占总数的 ，有个。单碱基重复序列的基序拷贝数分布范围最广，分布在，集中于。单至五碱基重复序列的拷贝数各不相同，分别为 次（单碱基重复序列），次（二碱基重复序列），次（三碱基重复序列），次（四碱基重复序列），次（五碱基重复序列）。总体而言，在各重复单元中拷贝数越小，碱基重复序列数量就越大（图）。讨论与结论叶绿体基因组以母系遗传，基因含量和顺序高度保守，分子进化缓慢，重组率低，因此叶绿体基因组结构和序列的信息在揭示物种起源、进化演变及其不同物种之间的亲缘关系等方面具有重要价值。在葱属植物中，莫冰棋等 对宽叶韭与峨眉韭叶绿体全基因组序列进行了系统发育分析与密码子使用特征的探究，为宽叶韭和峨眉韭的品种改良、遗传育种与叶绿体基因组工程等提供参考依据。但整体而言，在分子水平上对葱属植物进行的研究相对较少，所以，对蒙古韭叶绿体微卫星的研究，一方面可以弥补葱属植物在分子层面上的不足，另一方面也可以为其进一步进行 引物筛选、物种鉴定和遗传多样性研究提供理论基础。该研究将从野外采集到的蒙古韭样本进行叶绿体基因组测序，所得序列全长为 ，并利用 软件进行 位点检索，共识别出 个，平均每个位点之间的分布距离为 ，占总基因组的大小为 ，各类型重北方园艺月月（上上）图不同基序类型的拷贝数分布 复序列中，单碱基重复序列最多，约占重复序列总量的 。在基本相同的检索方式和准则下，和其它植物相比，双荚决明（）叶绿体基因组中平均每 出现一个 位点，红砂（）中每 出现一个 位点，龙船花（）中每 出现一个 位点，紫花苜蓿（）中每 出现一个 位点，女贞（）中每 出现一个 位点。相较而言，蒙古韭叶绿体微卫星位点分布密度更大，数量更为丰富。已有研究表明，含量与 的丰富程度相关，而碱基含量对叶绿体微卫星的分布也有一定的影响。对测得的蒙古韭叶绿体基因组进行分析后发现，其分布特征具有显著的单碱基偏倚性，出现频率 高 达 ，其 中 以占 绝 大 多 数（），明显高于 含量，在其它重复类型中也有类似情况的出现。这与已报道的其它物种一致，例如，在羊踯躅（）叶绿体基因组的简单重复序列中，和占位点总数量的 ；芜菁（）中叶绿体基因组 单核苷酸重复是最多的一类，占总 的 ；在姜（）的叶绿体基因组中观察到单核苷酸重复（）最常见，其次是二核苷酸重复（）。中的 甲基化容易产生突变，很可能是叶绿体 对 碱基具有偏好性的原因，而较少含量的 能够维持热力学稳定性。含量偏低，可能是 碱基比 之间所含能量更弱的原因，即 出现变异的情况比 更多，因而增加多态性 。该研究在蒙古韭叶绿体微卫星中发现了个重复基序，其在大多数植物的微卫星中很难见到或出现频率较低，有研究表明，序列中 含量的增加会使得某些氨基酸序列增加从而获得某些特定功能，例如胁迫抗性、信号转导、转录调控等，推测原因为，蒙古韭是一种在荒漠、砂地或干旱山坡等恶劣气候条件下生长的地被植物，其特征可能与 重复基序相关。第第期期 北方园艺 位点的多态性主要表现为其序列长度的多态性，而能够影响 长度多态性的主要因素除 了 碱 基 数，还 有 基 元 重 复 次 数。等 认为，的重复次数越多，其变异频率越高。在蒙古韭叶绿体 中，单碱基重复基序的重复次数类型最多，共种重复次数类型，跨度范围在重复 次；二至五碱基重复基序重复次数类型较少。研究表明，的长度 为低多态性，长度在 为中等多态性，长度 为高多态性。蒙古韭 长度区间为 ，从整体来看，长度主要集中在 ，在该范围内共有 个，占 总数的 ；长度 （包括 ）的有个，高多态性分子标记可以优先从这些候选标记中进行筛选。具有高度多态，共显性和易复制等优点，因此在遗传多样性分析和分子标记辅助育种等方面被广泛应用。传统的 标记对于引物的开发往往需要一系列复杂的基因组建库、重复片段富集、杂交、多个克隆筛选和桑格测序等操作步骤，但由于其效率低成本高，因此 标记只能用于具有高经济价值的模式植物上。随着近年来新一代测序技术带来的高通量优势，使测序工作的效率得到了极大的提升，同时，对物种的基因组及转录组进行大规模测序和精细分析也成为了一种简便的手段，极大地方便了 标记的开发。但在已发表的报道中还鲜见对蒙古韭进行 引物开发，该研究通过对蒙古韭叶绿体 特征进行分析，有助于蒙古韭的叶绿体微卫星引物开发，为蒙古韭进一步进行遗传标记开发、系统发育关系研究、种质资源利用等方面提供参考。参考文献王媛媛，杨美青 蒙古韭叶绿体基因组密码子使用偏好性分析分子植物育种，（）：张莹花，刘世增，尉秋实，等蒙古韭（）的分布和结实特性 中国沙漠，（）：侯燕茹 不同居群蒙古韭遗传多样性及其风味品质分析研究 呼和浩特：内蒙古农业大学，张美莉，高聚林 蒙古韭生物学特性及营养价值初探 内蒙古农业科技，（）：唐式敏蒙古韭主要生物学特性及生理基础的研究乌鲁木齐：新疆农业大学，斯琴巴特尔，刘新民蒙古韭的营养成分及民族植物学中国草地，（）：郝丽珍，杨忠仁，王六英，等三种葱属植物花形态及花药解剖结构观察植物研究，（）：秦丽丽蒙古韭（）遗传多样性研究呼和浩特：内蒙古师