酶催化合成L-茶氨酸的纯化研究进展_许锦雄.pdf

2023 年第 1 期摘要：L-茶氨酸是茶叶中独有的游离氨基酸，有浓厚的鲜甜味和诱人的焦香味，具有松弛神经紧张、安神等多种功效。对 L-茶氨酸的酶法合成进行了概括，并重点对酶催化合成 L-茶氨酸的纯化进行综述。关键词：茶氨酸；酶催化合成；分离纯化中图分类号：TS272文献标志码：Adoi：10.16693/ki.1671-9646（X）.2023.01.021Research Progress on Purification of Enzyme-catalyzed Synthesis of L-theanineXU Jinxiong，DU Yangji，WANG Yujia（Guangdong Guangye Qingyi Food Technology Co.，Ltd.，Guangzhou，Guangdong 511400，China）Abstract：L-theanine is a unique free amino acid in tea.It has a strong sweet taste and attractive burnt aroma，and has manyfunctions such as relaxation of nervous tension and soothing the nerves.This article summarized the enzymatic synthesis ofL-theanine，and focused on the purification of the enzyme-catalyzed synthesis of L-theanine.Key words：theanine；enzyme-catalyzed synthesis；separation and purification酶催化合成 L-茶氨酸的纯化研究进展许锦雄，杜阳吉，王钰佳（广东广业清怡食品科技股份有限公司，广东 广州511400）收稿日期：2022-05-29作者简介：许锦雄（1997），男，本科，助理工程师，研究方向为食品添加剂的研究与开发。L-茶氨酸属于酰胺类化合物，分子式为C7H14N2O3，是茶叶中独有的游离氨基酸。大量研究结果表明 L-茶氨酸具有多种重要的生理功能，所以在食品、保健品、医药等领域得到广泛的应用。目前市场上茶氨酸来源于化学合成、生物酶发酵，以及从天然茶树中提取1。化学合成反应剧烈，合成过程中使用的有毒溶剂，且会产生 D-茶氨酸。从天然茶树中提取 L-茶氨酸的效率最低，价格最贵。生物酶催化合成 L-茶氨酸反应温和，且不会产生D-茶氨酸。参考国内外有关文献对 L-茶氨酸的酶法合成进行了概括，且重点对酶催化合成 L-茶氨酸的纯化进行综述，以期能对 L-茶氨酸的研究开发和综合利用提供理论依据，为其生物合成工业化生产提供参考2。1酶催化合成 L-茶氨酸在 茶 树 中，L-茶 氨 酸 合 成 酶（Theaninesynthetase，TS）在 ATP 供能的条件下，催化 L-谷氨酸和乙胺合成 L-茶氨酸。Sasaoka 等人对 L-茶氨酸合成酶的研究表明该酶对乙胺具有高亲合力，但易分解且难纯化，L-茶氨酸的体外合成是不合适的，因而制约了它在 L-茶氨酸的体外合成。L-茶氨酸合成酶催化合成 L-茶氨酸见图 1。随着基因工程技术的进步，科研人员对酶促体外合成 L-茶氨酸进行了技术创新。L-茶氨酸体外合成见图 2。1.1L-谷酰胺酸酶催化L-谷氨酰胺酶是一种酰胺基水解酶，催化 L-谷氨酰胺的 -酰胺键水解为 L-谷氨酸和游离氨，在原核和真核生物中广泛分布。L-谷氨酰胺酶催化见图 3。孙帅3利用 L-谷酰胺酶催化 L-谷氨酰胺，系图 1L-茶氨酸合成酶催化合成 L-茶氨酸图 2L-茶氨酸体外合成图 3L-谷氨酰胺酶催化文章编号：1671-9646（2023）01a-0079-05第 1 期（总第 567 期）农产品加工No.12023 年 1 月Farm Products ProcessingJan.农产品加工2023 年第 1 期统以谷氨酰胺作为 -谷氨酰基给体，在反应过程中，谷氨酰胺易水解为谷氨酸。因此需要调整反应底物中的谷氨酰胺和乙胺的配比，以确保茶氨酸的产率最大化。研究得到谷氨酰胺酶催化合成茶氨酸的最适反应条件：反应体系（0.3 mol/L 谷氨酰胺，1.8 mol/L乙胺溶液，2 U 粗酶液，1 mmol/L Ca2+溶液，pH 值 9.8，浓缩 1.3 倍），46 下反应 6 h3-5。从分析结果看，谷氨酰胺酶法合成茶氨酸的最佳工艺条件产率仅为 0.239 g/L，这与茶氨酸的工业化生产的要求有很大差距。1.2-谷氨酰转肽酶（GGT）催化GGT 是一种能同时催化供体和受体基质的双底物酶，在不同的生物源中具有相似的催化性质和特异性。GGT 的催化机理是通过向受体基质中的 -谷氨酰基进行传递。在进行催化反应时，常采用2 个步骤进行，第一步用含有 -谷氨酰的化合物与对应的谷氨酰基结合，形成酶复合体；第二步，将结合的谷氨酰基转移到对应的受体基质上，如氨基酸、乙胺、水等。-谷氨酰转肽酶（GGT）催化见图 4。从图 4 可以看出，在这一过程中，GGT 对不同的受体底物进行了不同的反应。当以乙胺为受体，产生了转肽，从而生成了茶氨酸；在供体基质 L-Gln同时充当受体的情况下，会产生自转肽反应；当催化剂受体为水分子时，最终为水解反应。刘栓英，傅嘉懿，吕晶晶，李依韦等人，和斐等人，Komera Irene 等人，黄锋等人6-12用 GGT 催化L-谷氨酰胺与乙胺合成茶氨酸。在 35，pH 值为10.0，0.2 mol/L L-谷氨酰胺和 2 mol/L 乙胺在酶质量浓度为 1.0 U/mL 条件下反应得到茶氨酸 38.33 g/L。通过分批加料茶氨酸产量可达 58.73 g/L，茶氨酸的产率达 60%。该方法可以运用在茶氨酸的工业化生产上，由于副产物较多，后续的纯化分离具有挑战性。1.3L-谷氨酰胺合成酶（GS）催化合成GS（L-谷氨酰胺合成酶）以 L-谷氨酸盐和游离铵盐为原料催化合成 L-茶氨酸，同时通过三磷酸腺苷（ATP）水解提供能量辅助反应的进行。从Pseudomonastaetrolens Y-30 中提取的 GS 经过纯化后具有生产 L-茶氨酸的能力。编码 P.taetrolens Y-30中 GS 的基因序列已被测出，该序列能够在大肠杆菌中成功表达。重组的 GS 酶与原本 GS 酶具有相同特性，但酶产量比原菌高出 30 倍13。GS 的催化反应要求持续供给 ATP，所以还需要开发一种高效的 ATP 再生技术用于 L-茶氨酸的GS 合成。在最佳工艺条件下，GS 催化合成 L-茶氨酸的收率达到 28%。该收率较低，不适合工业化生产。1.4-谷氨酰甲胺合成酶（GMAS）催化合成研究表明，GMAS 显示出了比 GS 更高的结合乙胺的能力。M.mays NO.9 来源的 GMAS 在 ATP 持续供能的条件下，生产 L-茶氨酸产率可达到 110 g/L，远超于 P.taetrolens Y-30 来源的 GS。此外，利用固定化酶的技术将该酶固定化在硅藻土等载体上可以持续进行 6 次的高转化率反应生产 L-茶氨酸。朱新雅14利用 GMAS 酶在温度 32，pH 值8.0，以 L-谷氨酸和乙胺的加入量均为 150 mmol/L 作为反应物，细胞湿重为 50 g/L，反应 8 h 的条件下合成茶氨酸。此外还需在体系中加入 50 mmol/L 硫酸镁，100 mmol/L 六偏磷酸钠，5 mmol/L ATP 用于 ATP 循环的再生。最终，L-茶氨酸的产量为 20.68 g/L，转化率为 79.24%15。该方法虽然要加入 ATP，但目前ATP 再生系统工业化应用成熟，加上其茶氨酸转化率高，因此目前产业化生产茶氨酸主要利用该方法。2酶催化合成 L-茶氨酸的纯化为了酶的稳定催化，需要在反应体系中加入大量的磷酸盐、金属阳离子（Mg2+、Ca2+等），以及反应原料乙胺盐酸盐。由此可得，反应液的主要成分为阴阳离子，一部分变性蛋白、茶氨酸、谷氨酸。由于所有的物质均溶于水且不溶于大部分的有机溶剂，所以酶催化合成法比传统的化学合成后续纯化十分困难。根据反应液的组成，可以将纯化过程分为 3 步，分别是前处理过滤蛋白、细菌、脱色，除盐工艺，精制茶氨酸。下面根据该 3 步进行综述。2.1前处理纯化酶通过工程菌发酵后破壁得到，因此反应液中存在破碎的细胞器、除工程菌外的杂菌以及部分变形蛋白。这些杂质大部分不溶于水，因此可以通过简单的物理分离除去。2.1.1离心过滤离心过滤法是最简单的分离方法，在工业生产上运用成熟。通过离心，可以将大部分不溶性固体分离出来，再进行过滤可以得到清液。该方法分离速度快，且产物无损耗。其缺点也十分明显，无法除去杂菌、色素及部分水溶性蛋白。通常在过滤后还需加入活性炭进行脱色处理，但杂菌仍然无法除干净。2.1.2絮凝法图 4-谷氨酰转肽酶（GGT）催化802023 年第 1 期絮凝法用于除菌十分成熟，在谷氨酸的生产用十分常见，运用也十分成熟。通过加入化学絮凝剂，使得细菌等杂质被絮凝剂捕获，经过过滤后可除去。然而絮凝法操作起来比较繁琐，有时会产生毒性物质。而色素也无法通过该步骤完全除去16。2.1.3膜过滤随着材料学的不断发展，诞生了膜过滤这一方法。微滤膜具高效分离 0.110.0 粒度的优点，操作简单、绿色环保，适合用于 L-茶氨酸发酵液的菌体分离。超滤法也能用于分离分子量大于 5 kDa的物质17。L-茶氨酸发酵液大部分通过微滤膜和超滤膜组合进行初步分离提取。膜通量是衡量膜性能的一个重要指标，即单位时间内通过单位膜面积的滤过液体积。由于膜孔直径较小，在连续运行过程中容易出现堵塞，导致膜通量降低。影响膜通量的因素有许多，包括膜本身的性质。发酵液体最大的特性就是黏度高，随着黏度的增加，薄膜的渗透能力逐渐降低。随着温度的升高，其黏度也随之下降；但温度太高，微滤膜就会变得不稳定，细菌和其他不稳定的蛋白质会堵塞过滤膜，导致膜通量降低。一般情况下，微滤膜的分离压力为 0.030.03 MPa。在过滤开始后，在滤膜的表面会逐渐形成少量的胶体，如果压力差太小，过膜的动力就会减弱，从而使膜通量下降；如果压差太大，凝胶层会变厚，密度增大，不仅直接堵塞过滤膜，还抵消外部的压力，导致膜通量下降。膜过滤的原料易得，且更换率低，虽仍然无法去除色素，但在众多初级分离方法中分离效率最高。2.2除盐纯化为了酶的催化效率，反应体系中加入了大量的辅助盐，所以体系中杂质最多、最难除去的就是盐，除盐步骤对于分离纯化至关重要。由于茶氨酸溶于水且难溶于有机溶剂，因此简单萃取不能进行除盐。目前的除盐方法主要分 2 种，一是衍生法，即对茶氨酸进行化学修饰来改变其性状使得溶于某种溶剂或不溶于水，以此达到除盐的目的；二是物理方法，即通过离子交换树脂、大孔树脂、C18反向色谱柱、电渗析等方法，分离盐和茶氨酸。2.2.1沉淀法除盐利用特殊的有机试剂，按不同氨基酸的性质进行沉淀，实现与其他杂质的分离。在酶催化合成体系也适用，袁华等人18通过往加热反应液至 70，调节 pH 值至中性，加入碱式碳酸铜得到紫色沉淀物，沉淀物用 1 mol/L H2SO4溶解得到茶氨酸、碳酸铜混合液，通入 H2S 气体除去铜离子，加入适量氢氧化钡沉淀硫酸根离子后得到茶氨酸19。朱新雅14根据反应液的组成，计算后加入适量氯化铵，生成鸟粪石（Mg(NH4)PO4 6H2O），除去反应液中的磷酸根离子、镁离子。再通过重结晶得到茶氨酸纯品。2.2.2离子交换树脂除盐工业中常用的氨基酸分离方法是离子交换树脂法。茶氨酸的等电点是 5.6 左右，因此可以根据要除去杂质的酸碱性选择合适的离子交换树脂及洗脱液，纯化过程中不需要用到化学溶剂，绿色环保。（1）阳离子交换树脂。茶氨酸是典型的两性电解质，在 pH 值低于 5.6 的溶液中带正电荷，从而能与阳离子树脂上的交换基团结合。当 pH 值大于