棉花黄萎病相关基因GhMYB6的克隆与功能分析_代培红.pdf

53卷南 方 农 业 学 报 3020收稿日期：2022-04-09基金项目：国家自然科学基金项目（32160494）；新疆农业大学生物学创新团队开放项目（ITB202106）通讯作者：李月（1984-），https:/orcid.org/0000-0002-8394-8926，博士，副教授，主要从事作物逆境分子生物学研究工作，E-mail：liyue 第一作者：代培红（1979-），https:/orcid.org/0000-0003-0806-1361，副教授，主要从事作物抗逆分子生物学研究工作，E-mail：棉花黄萎病相关基因GhMYB6的克隆与功能分析代培红1，胡子曜1，李秀青2，雷建峰2，刘超1，刘晓东1，李月1*（1新疆农业大学生命科学学院，新疆乌鲁木齐830052；2新疆农业大学农学院/教育部棉花工程研究中心/农业生物技术重点实验室，新疆乌鲁木齐830052）摘要：【目的】克隆陆地棉MYB家族基因GhMYB6，并对其在棉花抗黄萎病反应中的功能进行初步探究，为挖掘棉花抗病相关基因及棉花抗病育种提供参考。【方法】基于棉花转录组测序数据，筛选并克隆了响应黄萎病菌侵染的基因GhMYB6，对其序列进行生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测其在黄萎病诱导下的表达模式，并利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术初步验证棉花抗黄萎病中的生物学功能。【结果】克隆获得的GhMYB6基因开放阅读框（ORF）为258 bp，编码85个氨基酸残基，理论等电点（pI）为9.34，脂肪系数为73.41，平均疏水性为-0.793，相对分子质量为9.86 kD，不稳定指数为73.41，为亲水性、碱性的非跨膜蛋白，无信号肽，定位于细胞核，在第1163氨基酸处含有1个SANT结构域。GhMYB6蛋白与雷蒙德氏棉GrMYB6聚在同一小分支上，说明二者的亲缘关系较近。GhMYB6基因在V991侵染后6和12 h时相对表达量较对照（未侵染处理，CK）极显著下调（P0.01），72 h时显著上调（P0.05）。与阴性对照植株TRV：00相比，GhMYB6基因沉默植株萎蔫程度和叶片黄化更严重，病情指数显著升高，茎秆的褐变程度更严重，且茎段在培养基上生长的真菌菌丝数量明显增多。【结论】GhMYB6基因响应黄萎病菌V991侵染，当抑制GhMYB6基因表达后，棉花对黄萎病菌的敏感性增强，抗性明显降低，推测GhMYB6是棉花抗黄萎病防御的一个正向调节因子。关键词：棉花黄萎病；MYB家族基因；基因克隆；病毒诱导的基因沉默（VIGS）；功能验证中图分类号：S562.035.3文献标志码：A文章编号：2095-1191（2022）11-3020-08Cloning and functional analysis of GhMYB6 gene related tocotton Verticillium wilt resistanceDAI Pei-hong1，HU Zi-yao1，LI Xiu-qing2，LEI Jian-feng2，LIU Chao1，LIU Xiao-dong1，LI Yue1*（1College of Life Sciences，XinjiangAgricultural University，Urumqi，Xinjiang 830052，China；2College ofAgronomy/Research Center of Cotton Engineering，Ministry of Education/Laboratory ofAgricultural Biotechnology，XinjiangAgricultural University，Urumqi，Xinjiang 830052，China）Abstract：【Objective】To clone GhMYB6 gene of MYB family in upland cotton and analyze its function in responseto cotton Verticillium wilt，so as to provide reference for exploring cotton genes related to disease-resistance and disease-re-sistant cotton breeding.【Method】Based on data of cotton transcriptome，the gene GhMYB6 in response to Verticilliumwilt infection was screened and cloned，and its sequences was analyzed by bioinformatics.Its expression patterns inducedby Verticillium wilt were detected by real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）.Biological function of cotton re-sistance to Verticillium wilt was preliminarily verified by virus-induced gene silencing（VIGS）technology.【Result】Gh-MYB6 open reading frame（ORF）was 258 bp，encoding 85 amino acid residues，with a theoretical point（pI）of 9.34，fatcoefficient of 73.41，average hydrophobicity of-0.793，relative molecular mass of 9.86 kD，instability index of 73.41，indi-cating that it encoded non-transmembrane，alkaline，hydrophilic protein located in the nucleus，with a SANT domain in the11th-63rdamino acids.Protein GhMYB6 and Gossypium raimondii GrMYB6 were clustered in the same small branch，indi-cating a close relationship between the two.After V991 infection，relative expression of GhMYB6 was extremely signifi-cantly down-regulated compared that of control（uninfected treatment，CK）（P0.01）at 6 and 12 h，significantly up-regu-南方农业学报Journal of Southern Agriculture2022，53（11）：3020-3027ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2022.11.00211期30210引言【研究意义】棉花（Gossypium hirsutum L）是我国重要的经济作物，易受到病虫害的危害，特别是黄萎病菌，严重影响其正常生长发育、制约纤维品质和产量（Wang et al.，2020）。目前最有效的黄萎病菌防控措施是选育抗病棉花品种，但由于陆地棉资源比较匮乏，采用传统方法选育抗病品种难度较大。因此，越来越多的研究人员借助转录组学、遗传学、基因组学等技术开展相关分子育种工作。转录因子通过调节相关防御相关基因的转录，并与其他调控因子的相互作用，在植物抵御病原体中扮演重要角色。MYB转录因子是植物中最大的一类转录因子家族，可通过调控抗逆相关基因的表达，参与抗病原体攻击的防御（朱英洁等，2021）。因此，开展棉花黄萎病相关的MYB转录因子基因克隆及功能分析，对筛选并培育棉花抗病新品种具有重要意义。【前人研究进展】自Paz-Ares等（1987）从玉米中鉴定出第一个MYB转录因子ZmMYBC1后，大量MYB家族基因从不同植物中相继被克隆出来，研究发现该家族基因在植物的新陈代谢、生长发育及抵御各种逆境胁迫中均发挥重要的调控作用。Ramrez等（2011）研究发现，AtMYB46负调节拟南芥抵抗灰霉病，是灰霉病菌的敏感调节因子。Meng等（2018）研究发现，抑制苹果MdMYB39L基因表达后，雄蕊的发育和花粉管的生长受到显著抑制。Zhao等（2018）研究发现，在拟南芥中过表达小麦TaMYB80基因后降低了转基因植株对高温和干旱胁迫的敏感性。Zhao等（2019）研究发现，在拟南芥中过表达小麦TaMYB31基因后增强了转基因植株的耐旱性。Wu等（2019）研究发现，玉米ZmMYB3R基因通过调控脱落酸（ABA）信号通路介导植株的抗旱及耐盐响应。Geng等（2020）研究发现，拟南芥MYB转录因子MYB20、MYB42、MYB43和MYB85通过调节次生细胞壁形成过程中苯丙氨酸和木质素的生物合成介导植株的生长发育。Zhu等（2020）研究发现，菊花CmMYB8基因通过抑制木质素和类黄酮合成，在菊花的生长发育中发挥负向调节的作用。Zhang等（2020）研究发现，番茄MYB15转录因子通过参与介导CBF途径，正向调节番茄的耐寒性。Yao等（2022）克隆海棠MbMYB108基因，将MbMYB108基因转入拟南芥后，其耐旱性和耐寒性大幅度提高。Hussain等（2021）从番红花中鉴定出一种R2R3-MYB转录因子（CstMYB14），其调节类胡萝卜素的活性氧响应生物合成，进而通过清除活性氧赋予应激耐受性。目前，已从陆地棉中共鉴定出812个MYB转录因子，其中有45个MYB转录因子功能被报道（朱英洁等，2021），其中GbMBY5（Chen et al.，2015）、GhRAX3（丁震乾等，2015）、GaMYB85（Butt et al.，2017）、Gh-MYB44（Hasan et al.，2019）和GhMYBPA1（张安红等，2020）等通过参与不同信号通路的调控，介导棉花抵御非生物胁迫的应激反应。【本研究切入点】目前对于陆地棉MYB转录因子功能研究主要集中在调控棉花的生长发育、纤维伸长、次生壁合成、花青素合成及抗非生物逆境反应等方面（朱英洁等，2021），但对于其参与棉花抵御黄萎病菌侵染的相关报道较少，该类转录因子在棉花抗黄萎病中的生物学功能尚不明确。【拟解决的关键问题】本研究通过前期转录组数据筛选得到1个响应黄萎病菌侵染的MYB家族基因GhMYB6，对其进行克隆鉴定及生物信息学分析，并利用病毒诱导的基因沉默（Virus-Inducedgene silencing，VIGS）技术初步验证其生物学功能，为研究MYB转录因子在棉花抗黄萎病反应中的分子机制及棉花黄萎病相关基因的筛选提供参考。1材料与方法1.1试验材料供试棉花材料为陆地棉（TM-1），其种子由新疆农业大学生命科学学院实验室保存；VIGS载体中的TRV：RNA1（辅助载体）、TRV：RNA2（阴性对照）、TRV：GhCLA1（阳性对照）和病原菌大丽轮枝菌菌株lated（P0.05）.After inhibiting GhMYB6 gene expression by VIGS technology，compared with the negative control plant TRV：00，wiltingand leaf yellowing of GhMYB6 gene silenced plants was more serious，th