猫传染性腹膜炎病毒N蛋白原核表达及多克隆抗体制备_赵飞宇.pdf

黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报第 35 卷收稿日期：2021-11-08基金项目：黑龙江八一农垦大学三横三纵科研团队支持计划（TDJH201804）。作者简介：赵飞宇（1996-），男，黑龙江八一农垦大学动物科技学院 2019 级硕士研究生。通信作者：孙东波，男，教授，博士研究生导师，E-mail：猫传染性腹膜炎病毒 N 蛋白原核表达及多克隆抗体制备赵飞宇，杨丹，赵鹏宇，李梓健，李璐，孙东波（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）摘要：为制备猫传染性腹膜炎病毒 N 蛋白特异性多克隆抗体，研究根据 HLJ/HRB/2016/11 毒株 N 基因序列设计引物，通过PCR 进行基因扩增，并将目的基因在 BamH、Hind 酶切位点克隆至 pET32a（+）原核表达载体上，将其转化到 BL21（DE3）感受态细胞，经终浓度为 1 mmol L-1的 IPTG 在 16 诱导 16 h 后，SDS-PAGE 检测表达产物，结果显示，在约 69 kda 处出现目的条带，且该蛋白主要以可溶形式表达。将重组 N 蛋白经 Ni 柱纯化后，按每只 BALB/c 小鼠免疫 50 g，三免后 7 d 采血分离血清，经间接 ELSA 检测结果显示，获得的 N 蛋白可被特异性识别且效价可达到 112 800。研究制备的猫传染性腹膜炎病毒 N蛋白及其多克隆抗体为后续猫传染性腹膜炎的疫苗提供基础。关键词：猫传染性腹膜炎病毒；衣壳蛋白；原核表达；多克隆抗体中图分类号：S852.4文献标识码：A文章编号：1002-2090（2023）01-0046-07Prokaryotic Expression of Feline Infectious Peritonitis Virus N Protein andPreparation of Polyclonal AntibodyZhao Feiyu，Yang Dan，Zhao Pengyu，Li Zijian，Li Lu，Sun Dongbo（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）Abstract：In order to prepare polyclonal antibodies specific for N protein of feline infectious peritonitis virus，primers were designedbased on the N gene sequence of HLJ/HRB/2016/11 strain，and the gene was amplified by PCR.The target gene was cloned intopET32a（+）prokaryotic expression vector at the BamH and Hind restriction sites.The protein was transformed into BL21（DE3）competent cells and induced by IPTG with a final concentration of 1 mmol L-1for 16 h at 16.SDS-PAGE detected the expressionproduct.The results showed that the target band appeared at about 69 kda，and the protein was mainly expressed in soluble form.Therecombinant N protein was purified by Ni column and immunized BALB/C mice at the rate of 50 g/mouse.Blood samples werecollected for serum separation at 7 d after the third immunization.Indirect ELSA detection showed that the obtained N protein couldbe specifically recognized with a titer up to 12 800.The feline infectious peritonitis virus N protein and its polyclonal antibodyprepared in this study would provide the basis for the subsequent feline infectious peritonitis vaccine.Key words：feline infectious peritonitis virus；capsid protein；prokaryotic expression；polyclonal antibodydoi:10.3969/j.issn.1002-2090.2023.01.008第 35 卷第 1 期2023 年2 月黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University35（1）：4652Feb.2023猫传染性腹膜炎是猫的一种全身性、致死性疾病，其病原为猫体内携带的猫冠状病毒（feline coronavirus，FCoV）发生突变后转变成对猫致命的猫传染性 腹 膜 炎 病 毒（feline infectious peritonitis virus，FIPV）而引起的一种疾病1，临床上会出现腹水、呼吸困难、葡萄膜炎和共济失调等症状2。FCoV 分布在世界各地，可感染所有猫科动物。FCoV 有两种致病型，一种是在肠上皮细胞中复制的非致病性猫肠道冠状病毒，另一种是在巨噬细胞中复制的致死性猫传染性腹膜炎病毒3。研究表明，FIP 在 6 月龄到 2 岁和大于 10 岁的两个发病高峰期，且雄性和未绝育的猫更容易发病，这可能与性激素分泌水平影响免疫系统第 1 期有关4。秋冬季节是 FIP 的死亡高峰期5。其致死率极高，对家猫的生存率造成极其严重的影响，对宠物行业造成巨大的损失6。FIPV 是一种有囊膜不分节段的单股正链 RNA 病毒，属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属7，呈螺旋状对称，囊膜表面有花瓣状纤突，在电子显微镜下呈日冕状8，主要由棘突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N），5个辅助蛋白（3a、3b、3c、7a、7b）及两个非结构蛋白 1a和 1b 组成9。FIPV 病毒的核衣壳由 RNA 结合多个 N 蛋白组成，FIPV N 蛋白约 50 kDa，属磷蛋白，在基因组 3 端附近编码10。N 蛋白由两个结构域（NTD 和 CTD）组成，这两个结构域通过不同的机制与病毒 RNA 结合，但二者的结合力是一样的，这两个结构域是 N 蛋白结合病毒 RNA 所必需的11。FCoV 和大多数冠状病毒的 N 蛋白作用一样，可使 RNA 避免遭受宿主核糖核酸酶降解12-13。此外，研究表明 N 蛋白具有较强的抗原性可诱导感染机体的细胞免疫反应。因此，N 蛋白可作为重要的疫苗开发靶标用于制备冠状病毒疫苗14。目前国内关于 FIPV 的研究较少，且无简单的诊断方法14-15。鉴于此，研究采用原核表达系统对 FIPVN 蛋白进行表达，并制备鼠源多克隆抗体，为猫传染性腹膜炎的诊断及预防奠定物质基础。1材料与方法1.1 主要试剂质 粒 提 取 试 剂 盒 购 自 OMEGA 有 限 公 司；T4 DNA Ligase 连接酶、限制性内切酶 BamH、Hind购自 NEB 有限公司；2Tap PCR Mix 预混酶、DNAmarker、Amp+均购自宝生物工程有限公司；IPTG 购自 Biosharp 公司；His 标签单克隆抗体购自碧云天生物技术公司；HRP 标记羊抗鼠 IgG 购自 Biosharp 公司；HRP 标记山羊抗猫 IgG 购自艾美捷科技有限公司。1.2 质粒、载体与实验动物pET32a-N-Fe 质粒和原核表达载体 pET32a（+）为黑龙江八一农垦大学猪病创新团队保存。68 周龄BALB/c 小鼠购自长春亿斯实验动物技术有限责任公司。1.3 引物设计选取猫传染性腹膜炎病参考毒株 HLJ/HRB/2016/11 N 蛋 白 基 因 的 核 苷 酸 序 列（GenBank：KY566210）根 据 中 登 陆 的 HLJ/HRB/2016/11 N（KY566210），利用 primer 5.0 软件设计两端带有特定酶切位点的引物，引物序列如下：上游引物：5-CGCGGATCCATGGGATCCATGGCGACC-3（下划线处 为 BamH 酶 切 位 点）；下 游 引 物：5-CCCAAGCTTTTAGTTGGTAACTTCGTCG-3（下划线处为 Hind 酶切位点）。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.4 原核表达载体的构建与鉴定以实验室保存的 pET32a-N-Fe 质粒为模板，利用引物通过 PCR 扩增出 FIPV-N 基因（1 134 bp），PCR 反应体系为：上游引物 0.2 L，下游引物 0.2 L，2Mix 预混酶 5 L，模板 1 L，ddH2O 3.6 L，总体积为 10 L。反应程序设定为：94 3 min，94 30 s，63 30 s，72 90 s，共进行 32 个循环。预先配置 1%琼脂糖凝胶配置，待 PCR 结束后将其产物进行凝胶电泳，紫外灯下观察，用手术刀片将目的条带处的胶块切下，进行胶回收。用 BamH 和 Hind 双酶切胶回收产物和pET32a（+）载体，体系为：10buffer（3.1）5 L，扩增产物 20 L，BamH 2 L，Hind 2 L，ddH2O 21 L。鉴定后，通过胶回收试剂盒将双酶切产物进行回收，对回收后的产物用 T4 连接酶进行定向连接，连接体系如下：4 L 目的基因片段，1 L 10buffer，1 L pET32a，1 L T4 连接酶。在 16连接仪中过夜。转化 BL21（DE3）感受态细胞后挑取单克隆进行PCR 和双酶切验证，阳性单克隆由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序鉴定，对测序结果进行分析。1.5 重组蛋白表达与分析将测序正确的阳性质粒命名为 pET32a-N 并转入 BL21 感受态细胞中。在平板上随机挑取单菌落于5 mL 菌液中，在 37 培养箱中振荡培养（160 rpm）。当 OD600 nm达到 0.6 时，加入终浓度为 1 mmol L-1的IPTG，放置于 16 摇床中过夜培养。取诱导后的菌液于 EP 管中，5 000g 离心 5 min，弃上清液。加 1 mL 预冷的 PBS 于 EP 管中并吹吸悬起菌体，5 000g 离心 5 min，弃上清液，重复此方法3 次。加 400 L 的蛋白裂解液，混合均匀后超声破碎（超 3 s，停 5 s，持续 1 min），直至菌液清亮不黏稠。超声后的样品在 4 条件下进行 12 000g 离心20 min，取上清液于无菌 EP 管中，并向沉淀中加入400 L 蛋白裂解液混合均匀，分别加 100 L 的 5赵飞宇等：猫传染性腹膜炎病毒 N 蛋白原核表达及多克隆抗体制备47黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报第 35 卷蛋白上样缓冲液，放入 100 沸水中作用 13 min 后将样品瞬离，再用分离胶浓度为 10%的 SDS-PAGE检测菌体的全菌、上清及沉淀，鉴定重组蛋白的可溶性。1.6 重组蛋白的诱导条件优化为提高重组蛋白表达量，对重组蛋白诱导时IPTG 及诱导时间进行优化。取 pET32a-N/BL21 重组菌于 40