酶底物法检测水中总大肠菌群影响因素的探讨_吴海鹏.pdf

广东化工2023年 第4期第50卷 总第486期酶底物法检测水中总大肠菌群影响因素的探讨酶底物法检测水中总大肠菌群影响因素的探讨吴海鹏(江门公用水务环境股份有限公司，广东 江门529000)摘要采用酶底物法测定水中总大肠菌群。通过正交实验从样品放置室温时间、培养温度、培养时间和稀释用水等方面探讨酶底物法测定水中总大肠菌群的各种因素的影响。实验表明样品放置室温时间对水中总大肠菌群的测定的影响因素最大，第二为培养温度，第三为培养时间，影响最低的为稀释用水。酶底物法测定水中总大肠菌群的条件为：室温放置时间在2023 min，培养温度在35.038.0，培养时间在2428 h，采用稀释溶液(爱德士公司)、灭菌生理盐水(自配)来稀释样品。关键词酶底物法；总大肠菌群；室温放置时间；培养温度；培养时间中图分类号X832文献标识码A文章编号1007-1865(2023)04-0160-03Discussion on Influencing Factors of Detecting Total Coliform inWater by Enzyme Substrate MethodWu Haipeng(Jiangmen Public Water Environment Co.,Ltd.,Jiangmen 529000,China)Abstract:The enzyme substrate method was used to determine the total coliform bacteria in water.The influence of various factors on the determination of totalcoliform bacteria in water by enzyme substrate method was discussed from the aspects of room temperature,culture temperature,culture time and dilution water.Theexperiment showed that the temperature of the sample was the most influential factor on the determination of total coliform bacteria in water.The second was culturetemperature,the third was culture time,and the lowest was dilution water.The conditions for the determination of total coliform bacteria in water by enzymesubstrate method were as follows:the incubation time was 2023 min at room temperature,the incubation temperature was 35.038.0,and the incubation timewas 2428 h.The samples were diluted with diluted solution(IDEXX Co.,Ltd)and sterilized saline(self-prepared).Keywords:enzyme substrate method；total coliform；room temperature storage time；culture temperature；cultivation time总大肠菌群是指一群在37培养24 h，能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌1。天然水体中含有多种微生物，有几万种，大部分对人体有益，只有一小部分能致病。水中致病微生物种类繁多，但数量较少、较易变异和死亡，而且目前还缺乏对这些病原体进行有效定量分离的方法 所以通常以易检测的水中指示微生物代替致病微生物来估计污染状况。总大肠菌群作为水体受粪便污染的一项重要卫生学指标已有近80年的历史，是目前国际上断定一个水体的污染程度和卫生质量以及是否适于生活或其他用途的主要生物指标2。当检测出总大肠菌群时往往预示水质受到了粪便污染，可进一步检测耐热大肠菌群和大肠埃希氏菌，以确定总大肠菌群是来自于人和动物粪便，还是来源于植物和土壤等自然环境。总大肠菌群目前常用检测方法有：多管发酵法、滤膜法、纸片法和酶底物法。多管发酵法作为传统检测技术至今有86年，适用于各种水样，但操作较繁，样品要进行10倍系列稀释、分离培养、革兰氏染色，产酸产气的发酵管需要镜检和证实验证，所需的时间较长3-4。滤膜法主要用于杂质较少的水样，操作与多管发酵法相比，相对简单，也需要进行验证实验3-4。纸片法按MPN法，将一定量的水样以无菌操作方式接种到特定的无菌滤纸上，在指定温度下培养24 h。通过指示剂颜色的变化(溴紫酚紫指示剂由紫色变为黄色，同时在产酸后的黄色背景下显示出红色斑点或红晕)来判断是否有总大肠菌群存在，再通过查MPN表得到相应的总大肠菌群的浓度值5-6。相对滤膜法、纸片法和多管发酵法，酶底物法具有操作简单，假阳性低、结果准确，对实验场所及人员无特殊要求等优点，且不需要做确认实验，检测时间较短，为24小时等特点7，不少检测机构开始采用酶底物法检测水中的总大肠菌群。为了提高酶底物法测定总大肠菌群的准确性，通过正交实验方法，考察不同影响因素和实验条件下各因子对总大肠菌群的影响，分析影响总大肠菌群测定值的主次因素，筛选出最优的测定条件组合，为总大肠菌群的测定提供参考。1实验方法与材料实验方法与材料1.1实验方法以水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃稀释菌的测定 酶底物法HJ 1001-20188和 生活饮用水标准检验方法 微生物指标GB/T 5750.12-2006中2.39为依据，设计出三水平四因素正交实验方案，考察样品稀释用水、培养时间、培养温度、样品室温放置时间对测定总大肠菌群的影响，筛选出最优的测定条件组合，为总大肠菌群的测定提供参考。1.2仪器设备手提式高压蒸汽灭菌器(上海申安DSX-18L)；电热恒温培养箱(上海沪越实验仪器有限公司303-3A)；程控定量封口机(美国爱德士生物科技公司Sealer Plus)；紫外灯：365366 nm；整支灭菌单道数字可调移液器(德国普兰德公司Transferpette-s，0.110000 uL)；量筒：100 mL、500 mL、1000 mL；稀释瓶：100 mL、250 mL、500 mL和1000 mL能耐高压的灭菌玻璃瓶。稀释瓶、采样器等玻璃器皿具在实验前按无菌操作要求包扎，121高压蒸汽灭菌20min，烘干、备用。1.3试剂和材料科立得酶底物试剂(美国爱德士生物科技公司)；97孔定量盘(美国爱德士生物科技公司Quanti-Tray/2000)；总大肠菌群酶底物法的标准阳性比色盘(美国爱德士生物科技公司)；总大肠菌群标准样品(美国nsi lab solutions公司，批号为：07020M，真值为：1770 MPN/100 mL，可信范围：600-3920 MPN/100 mL)；无菌水(取适量实验用水，经121高压灭菌20 min，备用)；自配灭菌生理盐水(配制适量的8.5 g/L的生理盐水，经121高压灭菌20 min，备用)；稀释溶液(美国爱德士生物科技公司)等。1.4分析步骤8-91.4.1样品稀释根据标准品的浓度范围、样品污染程度来确定接种量，避免接种样品培养后97孔定量盘出现全部阳性和全部阴性。当接种量少于100 mL时，应稀释样品后接种，接种量为10 mL时，取10 mL样品加入盛有90 mL无菌水的稀释瓶中混匀制成110的稀释样品，其它接种量的稀释样品依次类推8。量取100 mL样品或经过稀释的样品于灭菌后的瓶中，加入培养基粉末，充分混匀，完全溶解后，全部倒入97孔定量盘内，以手抚平97孔定量盘背面，将孔内气泡赶出来，然后用程控定量封口机封口。观察97孔定量盘颜色，若出现类似或深于标准阳性比色盘的颜色，则需排查样品、培养基、无菌收稿日期2022-08-11作者简介吴海鹏(1972-)，女，广东清远人，高级工程师，大学本科，主要研究方向为环境分析与水处理。2023年 第4期广东化工第50卷 总第486期161水等一系列因素后，终止实验或重新操作。对于未知的样品，应选用多个接种量进行检测8。1.4.2培养测定总大肠菌群时，将封口后的97孔定量盘放入电热恒温培养箱中培养，其中培养温度和培养时间按设计的实验要求进行。1.4.3对照实验1.4.3.1空白对照每次实验都要用无菌水按1.4.21.4.3进行实验室空白测定。培养后的实验室空白定量盘不得有任何颜色反应，否则该样品测定结果无效；如出现颜色，应排查原因后重新测定8。1.4.3.2阴性和阳性对照选取合适的阴性和阳性菌株，将标准菌株制成合适稀释度的菌悬液，按1.4.11.4.3进行测定。阳性菌株应呈现阳性反应，97孔定量盘样品为黄色，阴性菌株应呈现阴性反应，97孔定量盘样品的颜色无发生变化；否则，该次样品测定结果无效，应重新测定8。1.4.4结果判读与计数将培养后的97孔定量盘进行结果判读，任何与总大肠菌群酶底物法的标准阳性比色盘相同或更深的黄色，都被认定为阳性检测结果。如出现结果可疑，可延长培养时间，最长时间不应超过28 h10。分别记录97孔定量盘中大孔和小孔的阳性孔数量，从97孔定量盘法MPN表中查得每100 mL样品中总大肠菌群的结果8。1.4.5结果计算从97孔定量盘法MPN表中查得每100 mL样品中总大肠菌群的MPN值，再根据样品的稀释度，换算成样品的中总大肠菌群的浓度。1.5正交实验方案的设计参考水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃稀释菌的测定 酶底物法HJ 1001-2018的分析步骤，选取稀释用水、培养时间、培养温度、样品室温放置时间这4个因素作为考察因素进行正交实验，每个因素选取3个水平，通过测定总大肠菌群标准样品来观察各因素对实验结果的影响，具体的因素水平表见表1。表表1因素水平表因素水平表Tab.1Table of factors and levels水平稀释用水培养时间/h培养温度/样品室温放置时间/min1稀释溶液(爱德士)2234.0152灭菌生理盐水(自配)2436.0203无菌水(自配)2939.0302结果和讨论结果和讨论2.1正交实验与结果查正交表L9(34)得出本次样品的设计方案和正交结果，具体情况见表2。表2的实验结果表明，实验序号2时水中总大肠菌群的检测结果为1827.8 MPN/100 mL，它的相对误差最小为：3.3%。序号2的实验的条件为：稀释用水采用稀释溶液(爱德士公司)，培养时间为24 h，培养温度为：37.0，样品在室温放置的时间为20 min。实验数据表明：RDRCRBRA，即各因素对实验结果的影响主次为：样品在室温放置的时间的影响因素最大，第二为培养温度，第三为培养时间，影响最低的为稀释用水。稀释用水的影响程度较低，分别对四种的影响因素进行验证实验。K1、K2、K3分别代表水平1、水平2、水平3下总大肠菌群的平均值，通过极差R来评价各因素对考察指标的影响，R越大则该因素对考察指标影响越大。表表2正交实验结果正交实验结果Tab.2The results of orthogonal test实验序号因素A因素B因素C因素D总大肠菌群/(MPN/100mL)相对误差/%稀释用水培养时间/h培养温度/室温放置时间/min11111934.8-47.2212221827.83.331333845.0-52.3421231187.6-32.9522311330.6-24.8623121100.8-37.8731321511.2-14.683213724.8-59.193321944.2