铝纳米粉末活化树突状细胞的作用_朱歌.pdf

Chem.J.Chinese Universities,2023,44(2),2022060220220602(1/7)CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES高 等 学 校 化 学 学 报研究论文铝纳米粉末活化树突状细胞的作用朱歌1，李知涵2，刘堃2，孙天盟1（1.吉林大学第一医院,长春 130000；2.吉林大学化学学院,超分子结构与材料国家重点实验室,长春 130012）摘要 采用电爆炸法制备金属铝纳米粉末(ALEX),验证了其免疫增强效应及肿瘤预防效果.首先,利用铝金属丝电爆炸法,并应用羧基端基聚合物配体反应的方法合成了分散性良好的ALEX.利用静电物理吸附将抗原卵清蛋白(OVA)、抗原多肽(Peptide)接枝于ALEX表面,傅里叶变换红外光谱检测证明抗原与ALEX成功覆合.其次,验证了ALEX增强特异性免疫反应的效果.通过体外实验证明,ALEX可提高树突状细胞(DCs)的抗原提呈效果;同时,对免疫后小鼠血清抗体进行了定量检测,结果表明ALEX可显著提高小鼠体内抗原特异性抗体的水平.最后,利用小鼠黑色素瘤模型,验证了含有ALEX的肿瘤疫苗能够有效预防肿瘤的发生.关键词 铝纳米粉末；电爆炸法；树突状细胞活化；肿瘤疫苗中图分类号 O614；O631 文献标志码 A doi：10.7503/cjcu20220602Effect of Aluminium Nanopowders on Activation of Dendritic CellsZHU Ge1，LI Zhihan2，LIU Kun2，SUN Tianmeng1*（1.The First Hospital，Jilin University，Changchun 130000，China；2.State Key Laboratory of Supramolecular Structure and Materials，College of Chemistry，Jilin University，Changchun 130012，China）Abstract Aluminum nanopowders（ALEX）were prepared by electrical explosion and their effects of immune enhancing and tumor prevention were verified.The ALEX with well-dispersion were synthesized by electrical explosion of wires method，combing with carboxyl group polymer ligand reaction.The antigenic protein ovalbumin（OVA）and peptide was grafted onto ALEX surface by physical electrostatic adsorption.Fourier transform infrared spectroscopy demonstrated the grafting of antigen to ALEX.The immune enhancing effect of ALEX was verified：in vitro experiments showed that ALEX could improve the antigen presentation function of dendritic cells and the quantitative detection of antibodies in the serum of mice after immunization showed that ALEX could significantly increase the titer of antigen-specific antibodies.Finally，the tumor vaccine containing ALEX was proved to be effective for tumor prevention using mouse melanoma model.Keywords Aluminum nanopowders；Electrical explosion of wire；Activation of dendritic cell；Tumor vaccine疫苗作为一种主动免疫制剂，是人类公共卫生事业的重要组成部分，已经成为应对全球公共卫生问题的主要手段.随着疫苗的广泛应用，天花、小儿麻痹及麻疹等多种疾病的发病率显著降低，甚至被根除1.癌症是以自身细胞基因突变、异常分化无限增殖、逃避机体免疫监视、高浸润性和转移性为特征的一类疾病.通常情况下，肿瘤抗原的免疫原性差，难以有效激活机体免疫系统对肿瘤细胞进行识别和清除.此外，肿瘤的异质性和免疫微环境的特殊性使肿瘤疫苗的有效性受到极大的限制24.佐剂是一类非特异性免疫增强剂，是疫苗的重要组成部分，能够诱导机体对低免疫原性抗原产生免疫应收稿日期：2022-09-08.网络首发日期：2022-11-10.联系人简介：孙天盟,男,博士,教授,主要从事纳米材料用于肿瘤免疫治疗方面的研究.E-mail:基金项目：国家自然科学基金(批准号:32171379)资助.Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.32171379).CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES高 等 学 校 化 学 学 报研究论文Chem.J.Chinese Universities,2023,44(2),2022060220220602(2/7)答，从而解决抗原自身免疫原性差难以诱导免疫反应的问题5.肿瘤相关抗原被体内抗原提呈细胞（APCs）识别、加工处理后，通过APCs表面主要组织相容性复合体（MHC-/）-抗原复合物的形式，将抗原信息提呈给T/B淋巴细胞，启动适应性免疫反应.研究表明，预防肿瘤发生需要体液免疫和细胞免疫反应共同作用，其中抗体介导的体液免疫发挥主要作用，而控制肿瘤的生长则更依赖于细胞毒性T细胞介导的细胞免疫应答.因此，肿瘤疫苗对疫苗佐剂的性能提出了更高要求，在增强机体免疫反应强度的同时，要根据不同需求对机体免疫应答类型进行调控，从而实现肿瘤精准预防和治疗68.从1926年明矾作为佐剂投入使用开始，铝盐佐剂（主要包括磷酸铝和氢氧化铝），已成为目前应用最为广泛的疫苗佐剂，用于预防多种疾病的发生9，包括为应对近年来全球新型冠状病毒疫情而开发的多种疫苗也是以铝盐佐剂为主1013.在接近一个世纪的研究和临床应用中，铝盐佐剂的安全性已经得到广泛认可，也是首个被美国食品和药品管理局（FDA）批准用于人体的金属佐剂1416.尽管历史悠久、应用广泛，但铝盐佐剂仍具有局限性.铝盐佐剂是公认的体液免疫反应诱导剂17，其诱导细胞毒性T淋巴细胞介导的细胞免疫应答的效率非常低，只适用于体液免疫反应可治疗疾病的疫苗开发18.近年来，纳米技术的发展为开发适用于肿瘤疫苗的新型铝佐剂提供了思路1922.金属铝不同于金、银等传统贵金属元素，具有易加工、导热性强、热膨胀系数小及介电性能好等特性23.金属铝纳米粉末的合成方法主要包括电爆炸法24、电子束光刻法25、热分解法和催化分解法26.热分解法和催化分解法属于化学合成法，制得的金属纳米粒子具有形貌均一及分散性好等优势，但因金属铝具有高还原电位很难被一般的还原剂还原，同时缺少合适的表面配体，化学合成法在铝纳米粉末制备工程中发展相对缓慢.电爆炸法和电子束光刻法属于物理合成法，电子束光刻法是将高速的电子打在光刻胶表面，改变光刻胶的化学性质，该方法制备的金属铝纳米粉末粒度均匀、纯度高，但对仪器要求高、产量小25.电爆炸法是指当强脉冲电流通过金属导体丝时，电阻的加热作用迅速将电能转化为热能，使导体丝物理状态发生变化，经过固态加热、熔化汽化、爆炸、电弧击穿及冷凝阶段，得到高纯度纳米粒子的方法，具有产量高、通用性强及污染小等优点24，但传统电爆炸法没有提供外加配体，制备的金属铝纳米粉末表面能很高，通常表现为尺寸在微米级的聚集体形式，如何实现分散聚集态粒子是目前面临的主要挑战.本文利用金属丝电爆炸法制备形貌均一、分散性良好的金属铝纳米粉末（ALEX），建立了ALEX与抗原蛋白（OVA）和抗原多肽（Peptide）的复合方法，验证了其增强抗原特异性免疫反应的能力.在小鼠黑色素瘤模型中可有效预防肿瘤的发生，为肿瘤疫苗的开发提供了有效策略.1 实验部分1.1试剂与仪器羧基端基聚苯乙烯，分析纯，加拿大Polymer Source公司；甲苯溶剂及N，N-二甲基甲酰胺（DMF），分析纯，上海安耐吉试剂公司；铝金属丝，直径0.2 nm，纯度99%，深圳鸿金泰公司；磷酸盐缓冲液（PBS），上海龙田技术有限公司；抗原卵清蛋白（OVA），美国Sigma Aldrich公司；抗原多肽（Peptide），上海吉尔生化有限公司；铝凝胶佐剂 Al（OH）3，美国Thermo Fisher Scientific公司；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），美国Pepro Tech公司；白介素-4（IL-4），美国Pepro Tech公司；RPMI1640培养基，美国Thermo Fisher Scientific 公司；Anti-CD11c-APC/Cy7和H-2Kb-APC抗体，美国Biolegend公司；OVA特异性IgG1及IgG2a抗体酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒，美国Alpha Diagnostic Intl公司.雌性SPF级别C57BL/6小鼠，68周，体重1618 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）-2016-0016.B16F10-OVA黑色素瘤细胞系为本实验室细胞库提供.RPR-100型光化学反应器，美国Rayonet公司；Hitachi-800型透射电子显微镜（TEM），日本日立公司；Vertex 80V型傅里叶变换红外光谱仪（FTIR），美国Bruker公司，4000400 cm-1；Nano-S90型动态光散射仪（DLS），英国Malvern公司；PerkinElmer Lambda 950型紫外-可见（UV-Vis）分光光度计，美国PerkinElmer公司；Eppendorf F-45-12-11型离心机，德国Eppendorf公司.多功能微孔板检测仪，瑞士CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES高 等 学 校 化 学 学 报研究论文Chem.J.Chinese Universities,2023,44(2),2022060220220602(3/7)TECAN公司；LSR Fortessa型流式细胞仪，美国Becton Dickinson Biosciences公司.1.2实验过程1.2.1铝纳米粉末的合成在氩气环境中，将铝金属丝固定在高压电极之间（所用供电器储存电容为96 F，电极的预放电电压为4.04.4 kV），在100 kA的电流强度下，铝丝被加热并发生径向膨胀，迅速汽化形成铝蒸汽，随后冷凝形成ALEX，在充满氩气的收集器中收集样品.后续反应在氮气环境及800 r/min搅拌条件下进行，将1 mg ALEX和5 mg羧基端基的聚苯乙烯（数均分子量为4700，分散度1.09）分别加入含有2 mL甲苯的Slank瓶中，在液氮条件下反复冻融3次，在80 下反应24 h，反应溶液逐渐变成黑色均匀液体，以10000 r/min的速度离心15 min后用等体积甲苯反复洗涤5次，得到分散性良好的ALEX.1.2.2铝纳米粉末与抗原的复合物（ALEX-OVA）制备超声条件下将5 mL浓度为2 mg/