鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒双重PCR检测方法的建立_林而舒.pdf

林而舒，卓玉琛，陈斌，等.鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒双重 PCR 检测方法的建立J.福建农业学报，2022，37（11）：13941399.LIN E S,ZHUO Y C,CHEN B,et al.Establishment and application of duplex PCR detection system between Anguillid herpesvirus and EelcircovirusJ.Fujian Journal of Agricultural Sciences，2022，37（11）：13941399.鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒双重 PCR检测方法的建立林而舒，卓玉琛，陈斌，林煜，钟全福，樊海平，曾占壮（福建省淡水水产研究所，福建福州350002）摘要：【目的】建立能同时检测鳗鲡疱疹病毒（Anguillid herpesvirus，AHV）与鳗鲡圆环病毒（Eel circovirus，EeCV）的双重 PCR 法。【方法】优选 PCR 引物组合，建立鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒的双重 PCR 检测方法，探究双重 PCR 扩增条件，并检验该方法的特异性、灵敏性和临床样品检测效果。【结果】双重 PCR 法同时扩增出鳗鲡疱疹病毒 690bp 和鳗鲡圆环病毒 338bp 特异性片段，与猪圆环病毒（Porcine circovirus）、鸭圆环病毒（Duckcircovirus）、锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus）和鲤疱疹病毒（Cyprinid herpesvirus）的核酸不发生扩增反应。鳗鲡疱疹病毒和鳗鲡圆环病毒重组质粒标准品的最低全检出量为 5.010-4gmL-1。用所建立的双重 PCR 方法对 50 份临床病鳗进行检验，其中鳗鲡疱疹病毒的感染率为 16%，鳗鲡圆环病毒的感染率为 68%，共感染率为 8%。该感染率与单一 PCR 检测结果完全一致。【结论】建立的鳗鲡疱疹病毒和鳗鲡圆环病毒双重 PCR 检测法不仅特异性强、灵敏度高、重复性好，而且临床应用效果佳，为鳗鲡疱疹病毒和鳗鲡圆环病毒的快速检测提供了有效的技术支持。关键词：鳗鲡疱疹病毒；鳗鲡圆环病毒；双重 PCR；检测方法中图分类号：S941文献标志码：A文章编号：1008-0384（2022）11139406Establishment and application of duplex PCR detection system between Anguillidherpesvirus and Eel circovirusLINErshu,ZHUOYuchen,CHENBin,LINYu,ZHONGQuanfu,FANHaiping,ZENGZhanzhuang（Freshwater Fisheries Research Institute of Fujian Province,Fuzhou,Fujian350002,China）Abstract:【Objective】TheaimofthepresentstudywastoestablishaduplexPCRmethodfordetectionofAnguillidherpesvirusandEel circovirus.【Method】RoutinePCRprimerswerepreferredtooptimizetheamplificationconditionsandtestthespecificityandsensitivityofthemethod.Atthesametime,thesickeelofsuspectedcasescollectedfromdifferentfarmweredetectedbytheduplexPCRmethod,andcomparedwiththeroutinePCRmethod.【Result】Theresultsshowedthatthespecificfragmentsof690bpand388bpwereamplifiedbyusingtheduplexPCRfromDNAsamplesofAnguillid herpesvirusand Eel circovirus,respectively.But the nucleic acid amplification results of Porcine circovirus,Duck circovirus,Koiherpesvirusand Cyprinid herpesviruswerenegative.WhenthepositiveDNAconcentrationsofbothAnguillid herpesvirusandEel circovirus were diluted to 5.010-4 gmL-1,the corresponding target fragments could still be detected.50 samplescollectedfromsuspectedcasesofsickeelswerediagnosedbyPCR.TheinfectionrateofAnguillid herpesviruswas16%.Theinfection rate of Eel circovirus was 68%.The infection rate of Anguillid herpesvirus andEel circovirus was 8%.【Conclusion】TheresultsindicatethattheduplexPCRdetectionmethodhascertainspecificityandsensitivity,andcanbeused for the detection and differential diagnosis of recessive cases of clinical infection of Anguillid herpesvirus and EelcircovirusKey words:Anguillid herpesvirus；Eel circovirus；duplexPCR；testmethod收稿日期：20220810初稿；20221105修改稿作者简介：林而舒（1993），女，硕士，助理农艺师，研究方向：水产病害（E-mail：）基金项目：福建省科技计划公益类专项（2022R11010014-5、2023R11010017-4）福建农业学报2022，37（11）：13941399http:/Fujian Journal of Agricultural Sciencesdoi:10.19303/j.issn.1008-0384.2022.011.0040引言【研 究 意 义】鳗 鲡 疱 疹 病 毒（Anguillidherpesvirus，AHV）是线性双链 DNA 病毒，基因组全长 248kb，含 136 个开放阅读框1。AHV 毒株的首次分离是由 Sano 等从日本鳗鲡（Anguilla japonica）体内分离得到的2。鳗鲡疱疹病毒病鳗常呈现“脱黏”“红头”“败血”等临床症状3。鳗鲡圆环病毒（Eelcircovirus，EeCV）是小型的环状单链 DNA 病毒，包含两个主要的开放阅读框，以相反的方向排列，编码复制启动蛋白和衣壳蛋白。其临床症状主要表现为头部发红、鱼体腹部出血点、鳃部溃烂、部分病鱼喉部囊肿增生物，与鳗鲡疱疹病毒临床症状非常相似46。随着国内鳗鲡行业的不断发展，鳗鲡养殖过程中出现的相关疾病越发得到重视7。鳗鲡疱疹病毒病和鳗鲡圆环病毒病在鳗鲡养殖过程中发生日趋频繁，由于两者的临床症状有许多相似之处，且常混合感染，难以肉眼进行区分1,4。因此亟需建立一种快速、简便且能够同时检测这两种常见鳗鲡病毒性疾病的检测方法，为其流行病学调查及防控提供技术基础。【前人研究进展】目前已报道的 AHV 和EeCV 的检测方法包括免疫过氧化物酶单层实验法、免疫间接荧光抗体实验法、原位杂交法和荧光定量PCR 法。这些方法都存在一定的局限性，如需要特定抗体、抗体获取难度较大、所需仪器价格昂贵、操作复杂和对操作人员身体有害等1,810。双重PCR 检测方法能够在同一 PCR 反应管中同时检测两种病毒，操作简单，检测时间和检测成本得以大大降低，且双重 PCR 检测方法具有特异性强和敏感性高等优点1113。该方法在动物疫病检测领域已经广泛应用，如苗艳等14于 2022 年建立了鸽疱疹病毒和鸽痘病毒双重 PCR 检测方法；徐通等15于 2021年建立了猪圆环病毒型和型双重 PCR 检测方法。鳗鲡疱疹病毒和鳗鲡圆环病毒已经分别建立了普通 PCR 检测法和荧光定量 PCR 法1,4,16。【本研究切入点】但是关于两者同时检测的双重 PCR 检测方法还未见报道。【拟解决的关键问题】本研究筛选组合引物对，优化反应体系及反应条件，建立同时检测鳗鲡疱疹病毒和鳗鲡圆环病毒的双重 PCR 方法，为这两种鳗鲡病毒性疾病的诊断、流行病学调查及病害防控提供技术支持。1材料与方法1.1病鳗与病毒20212022 年期间，于福建省大田、邵武、福清和江西武宁、吉安等地区的鳗鲡养殖场采集具有红头、脱黏、烂鳃后“开窗”、喉部囊肿等临床症状的疑似鳗鲡病样。猪圆环病毒（Porcine circovirus）DNA 由福建农林 大 学 动 物 科 学 学 院 馈 赠；鸭 圆 环 病 毒（Duckcircovirus）DNA 由福建省农业科学院馈赠；锦鲤疱疹 病 毒（Koi herpesvirus）DNA 和 鲤 疱 疹 病 毒（Cyprinid herpesvirus）DNA 由中国水产科学研究院长江水产研究所馈赠。1.2主要试剂海洋动物基因组 DNA 提取试剂盒购自天根生化科 技（北 京）有 限 公 司；PremixTaqTM（ExTaqTMVersion2.0plusdye）试剂盒和质粒抽提试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司；T 载体 PCR 产物快速连接试剂盒、DNAMarker、DiaSpin 柱式 DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。1.3引物合成试验所用引物均由上海生物工程（生工）有限公司合成，用于扩增鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒的特异性序列（表 1）。表 1 引物列表Table 1 Primer list引物名称Primername引物序列(5-3)Primersequences(5-3)目的片段大小Primersize/bp参考文献ReferenceAHV-49FGGATCCATGATTTGTTGGGCGG6901AHV-49RGAATTCTCATACGCAGCTCCCAAGEeCV-FACGACCAGCATAACAAGGA3884EeCV-RAACCAGCCGTAGAAATCAT1.4制备模板 DNA将患病鳗鲡的皮肤黏液、鳃部和肝脏等重要组织剪碎混合，后使用海洋动物基因组 DNA 提取试剂盒提取病毒总 DNA，放置于20 保存备用。第11期林而舒等：鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒双重 PCR 检测方法的建立13951.5制备阳性重组质粒以含 AHV 和 EeCV 的 DNA 为模板进行 PCR，反应体系如下（20L）：模板 DNA2L，2PCRMix10 L，ddH2O 4 L，AHV 上 游、下 游 引 物（10mol.L-1）和 EeCV 上游、下游引物（10mol.L-1）各1.0L。反应条件：94 预变性 5min；94 变性30s，55 退火 30s，72 延伸1min，循环 30 次；72 延伸 10min。扩增产物通过 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，再使用胶回收试剂盒回收条带大小正确的 PCR 产物。将 T 载体与回收的 PCR 产物连接，并转化至 DH5 感受态细胞中，过夜培养。挑选并PCR 鉴定单菌落，然后将初步鉴定准确的阳性重组质粒 T-AHV 和 T-EeCV 送至生工生物工程（上海