马铃薯叶片内生细菌的分离鉴...其对马铃薯块茎蛾的毒力研究_杨金睿.pdf

11期3147南方农业学报Journal of Southern Agriculture2022，53（11）：3147-3156ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2022.11.015收稿日期：2022-03-26基金项目：国家自然科学基金项目（32060616，31760519）；云南农业大学学生科技创新创业行动基金项目（2022ZKYX149）；云南省教育厅科学研究基金项目（2020Y206）通讯作者：肖关丽（1972-），https:/orcid.org/0000-0003-4603-7274，博士，教授，主要从事植物生理研究工作，E-mail：第一作者：杨金睿（1995-），https:/orcid.org/0000-0003-2756-3383，研究方向为马铃薯内生菌，E-mail：马铃薯叶片内生细菌的分离鉴定及其对马铃薯块茎蛾的毒力研究杨金睿1，吉泽1，李俊逸1，姚遥1，祝春月1，王文倩2，肖关丽1*（1云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明650201；2云南农业大学植物保护学院，云南昆明650201）摘要：【目的】研究马铃薯叶片内生细菌对马铃薯块茎蛾幼虫的杀虫活性，为马铃薯块茎蛾生物防治提供理论依据。【方法】以云南省2种马铃薯主栽品种丽薯6号和会-2叶片为材料，采用LB固体培养基分离培养马铃薯叶片内生细菌，根据内生细菌的形态特征和16S rDNA序列进行种类鉴定；通过浸叶饲喂法测定内生细菌的发酵液、发酵上清液和菌悬液对马铃薯块茎蛾3龄幼虫的毒力。【结果】分别从丽薯6号和会-2叶片中分离获得对马铃薯块茎蛾3龄幼虫具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）QL1和带化红球菌（Rhodococcus fascians）YH2。分别用浓度为1.5109CFU/mL的菌株QL1和YH2发酵液饲喂马铃薯块茎蛾3龄幼虫后第7 d时，其幼虫累积死亡率分别为81.67%和65.00%，LT50分别为3.03和5.58 d；菌株QL1发酵液处理后第3、5和7 d马铃薯块茎蛾3龄幼虫的LC50分别为7.99108、3.21106和2.73103CFU/mL；菌株YH2菌体无明显致死效应。在1.5109CFU/mL浓度下，菌株QL1和YH2发酵液对马铃薯块茎蛾3龄幼虫的杀虫活性高于发酵上清液和菌悬液。菌株QL1和YH2的发酵液、发酵上清液、菌悬液处理后马铃薯块茎蛾3龄幼虫的累积死亡率均随着处理时间变长而逐渐升高。【结论】马铃薯叶片内生细菌苏云金芽孢杆菌菌株QL1和带化红球菌菌株YH2的发酵液、发酵上清液、菌悬液对马铃薯块茎蛾3龄幼虫均具有杀虫活性，可作为马铃薯块茎蛾生防制剂开发的潜力菌株。关键词：马铃薯；内生细菌；马铃薯块茎蛾；毒力测定；杀虫活性；生物防治中图分类号：S436.32文献标志码：A文章编号：2095-1191（2022）11-3147-10Isolation and identification of endophytic bacteria in potatoleaves and their virulence to Phthorimaea operculellaYANG Jin-rui1，JI Ze1，LI Jun-yi1，YAO Yao1，ZHU Chun-yue1，WANG Wen-qian2，XIAO Guan-li1*（1College ofAgronomy and Biotechnology，YunnanAgricultural University，Kunming，Yunnan 650201，China；2College of Plant Protection，YunnanAgricultural University，Kunming，Yunnan 650201，China）Abstract：【Objective】To study insecticidal activity of endophytic bacteria in potato leaves against Phthorimaea oper-culella larvae，and to provide theoretical basis for biological control of P.operculella.【Method】Leaves of 2 main potatovarieties Lishu No.6 and Hui-2 in Yunnan Province were used as materials.Endophytic bacteria in the potato leaves wereisolated and cultured on LB solid medium.Species of endophytic bacteria were identified based on the morphological chara-cteristics and 16S rDNA sequence.Virulence of fermentation broth，fermentation supernatant and bacterial suspension tothe 3rdinstar larvae of P.operculella were determined by leaf immersion feeding method.【Result】Bacillus thuringiensisQL1 and Rhodococcus fascians YH2 with insecticidal activity against P.operculella 3rdinstar larvae were isolated from theleaves of the Lishu No.6 and Hui-2，respectively.P.operculella 3rdinstar larvae were treated with strains QL1 and YH2fermentation broth at 1.5109CFU/mL on the 7thday，and the cumulative mortality rates were 81.67%and 65.00%，andthe LT50were 3.03 and 5.58 d，respectively.P.operculella 3rdinstar larvae treated with strain QL1 fermentation broth atthe 3rd，5thand 7thd，and their LC50were 7.99108，3.21106and 2.73103CFU/mL，respectively.The strain YH2 bacte-53卷南 方 农 业 学 报 31480引言【研究意义】马铃薯是我国第四大粮食作物，除自然资源条件外，虫害是制约我国马铃薯单产进一步提升的重要因素（徐进等，2019）。马铃薯块茎蛾（Phthorimaea operculella）是一种世界性农业害虫，对马铃薯植株和块茎均有危害，严重影响马铃薯的产量和品质，已在我国南方马铃薯主产区大范围发生，尤其是在云南等地发生严重（闫俊杰等，2019）。在我国大力推进绿色农业发展的今天，为促进马铃薯产业的可持续发展，采取以微生物等为基础的绿色生物防治技术是马铃薯块茎蛾防控的重要举措。植物内生细菌作为一种新型微生物资源，其丰富的微生物种类为寻找新型抗虫微生物及其活性物质提供了可能。因此，从不同马铃薯品种中探寻对马铃薯块茎蛾有防治作用的内生细菌具有重要的研究开发价值。【前人研究进展】植物内生菌（Endophyte）是指生长在植物各种不同组织内部但又不会引起植物表观症状的微生物（Sturz et al.，2000），主要包括内生细菌、放线菌以及真菌3大类，普遍存在于不同的植物中（张鑫，2018），在植物不同组织及其器官内广泛分布（贾颜等，2021）。当前文献报道的马铃薯内生细菌研究大多集中在马铃薯块茎方面，研究人员通过传统分离培养和高通量测序发现的马铃薯内生细菌主要包括假单胞菌属（Pseudomonas）、微球菌属（Micrococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、红球菌属（Rhodococcus）、肠杆菌属（Enterobacter）和鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）等（屈青松等，2016；戴超，2017；Liu et al.，2020；Shi et al.，2021）。在马铃薯内生细菌功能的研究中，研究人员通过内生细菌菌悬液浸泡马铃薯种薯块茎后，根据其生长状况筛选出对马铃薯植株生长发育或致病产生影响的菌株（Isti-fadah et al.，2018）；也有采用平板培养法发现对马铃薯病原真菌有高抑制率的芽孢杆菌属内生细菌萎缩芽胞杆菌（B.atrophaeus）和贝莱斯芽胞杆菌（B.velezensis）（陈星伊等，2020），而关于内生细菌防治马铃薯块茎蛾的研究则鲜有报道。微生物防治已成为近年来绿色防控马铃薯块茎蛾的研究热点，如苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）已被应用于防治马铃薯块茎蛾，B.thuringiensis ssp.Kurstaki（Btk）是一株商用苏云金杆菌菌株，可制成可湿性粉剂作为化学杀虫剂的替代品，在马铃薯收获前施用以抵御马铃薯块茎蛾幼虫在田间对块茎的侵害，降低储藏过程中块茎被侵染的风险（Arthurs et al.，2008）；以浸虫法测定球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株SD对马铃薯块茎蛾1龄幼虫的毒力作用，10 d后致死率高达98%，处理后的幼虫产卵量、生长发育期和后代的净繁殖率均显著降低，对马铃薯块茎蛾造成潜在的长期影响（Yuan et al.，2017）；采用金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）、莱氏野村菌（Nomuraearileyi）和细脚拟青霉（Paecilomyces tenuipes）的孢子悬浮液浸泡处理马铃薯叶片和块茎，对取食的马铃薯块茎蛾幼虫均有杀虫作用，还可降低成虫羽化率和卵孵化率，其中莱氏野村菌对防治初孵幼虫侵入马铃薯块茎的效果最好（Khorrami et al.，2018）；通过浸叶法测定发现黏质沙雷氏菌（Serratia marce-scens）菌株ML-1不同成分对马铃薯块茎蛾幼虫均有较强的杀虫活性（苏造堂，2020）。【本研究切入点】目前用来防治马铃薯块茎蛾的生防菌较少，对马铃薯内生细菌的开发利用仍处于早期阶段，且尚未有通过马铃薯可培养内生细菌防治马铃薯块茎蛾的研究报道。【拟解决的关键问题】以云南省2种马铃薯主栽品种丽薯6号和会-2为材料，采用LB培养基分离培养马铃薯叶片内生细菌，根据内生细菌的形态特征和16S rDNA序列进行种类鉴定；通过浸叶饲喂法测定内生细菌的发酵液、发酵上清液和菌悬液对马铃薯块茎蛾的杀虫活性，以期为马铃薯块茎蛾的生物防治提供菌种资源和理论依据。ria did not obviously affect mortality of P.operculella 3rdinstar larvae.At 1.5109CFU/mL，insecticidal activity againstP.operculella 3rdinstar larvae of strains QL1 and YH2 fermentation broth were stronger than of fermentation supernatantand bacterial suspension.Furthermore，as time went on，the cumulative mortality rates increased