逆转录酶基因过表达或沉默对HL-1细胞钠电流的作用_但晴.pdf

基础研究逆转录酶基因过表达或沉默对 细胞钠电流的作用但晴陈雅婷，庄文娟刘传斌白婧董颖林琨李泱 摘要目的研究逆转录酶（）基因过表达或沉默对细胞钠电流（）的作用。方法构建 基因过表达或沉默慢病毒载体，感染细胞，分为过表达慢病毒载体（）组、对照载体（）组、干扰慢病毒载体（）组、对照载体（）组。应用定量荧光原位杂交（）方法测定端粒长度，应用 法绘制细胞生长曲线，应用全细胞膜片钳技术记录。结果 组细胞端粒长度明显延长，从 延长至 （，），且增殖能力明显增强；去极化时，与 组比较，组细胞 电流密度从（）增至（）（，）。而与 组比较，组 电流密度从（）降至（）（，）。组钠通道稳态失活曲线右移，通道关闭态失活时间延长，失活后恢复加速，组的效应恰好相反。而 组、组钠通道稳态激活和中间态失活变化不大。结论 基因对细胞 有明显的调控作用，这可能是其改变心房肌细胞电生理的机制之一。关键词心血管病学；逆转录酶基因；细胞系；钠电流；膜片钳 ：中图分类号 文献标识码文章编号 （）国家自然科学基金资助（面上项目，）作者单位：中国人民解放军总医院第一医学中心心血管内科（北京 ）解放军医学院（北京 ）中国人民解放军总医院第六医学中心心血管病学部（北京 ）北京市昌平区沙河医院（北京 ）作者简介：但晴（），女（汉族），四川自贡人，主管技师，硕士，研究方向为心脏基础电生理。通 讯 作 者：李 泱，：；林 琨，：，；，；，；，：，：；，：（）（），：，（），（）（，），（）（）（；，）（）（）（；，），（）：中国心脏起搏与心电生理杂志 年第 卷第期 ；研究显示，衰老相关分子端粒长度缩短与心房颤动（简称房颤）发生密切相关。但其影响房颤发生的具体机制尚不清楚。衰老或组织改变的核心是端粒介导的 损伤，维持端粒长度的主要机制是通过端粒酶对端粒重复序列进行延伸，其中逆转录酶（，）在延长端粒中起着关键作用。研究显示，传导障碍是房颤的主要电重构特征。而决定心房传导速率的离子流基础主要来自钠电流（），心房的异位节律也与 密不可分。笔者通过 基因过表达和沉默直接作用于细胞，观察 对细胞膜上 的影响，试图从细胞电生理角度解释端粒酶在房颤发生中的作用。材料与方法溶液与试剂蛋白酶、胶原酶、天门冬氨酸钾、丙酮酸钠、三 磷 酸 腺 苷 镁（，）、牛 血 清 白 蛋 白、河 豚 毒（，）、氨基吡啶（，）均购于 公司；乙二醇醚二胺四乙酸（，）购于 ；其他试剂均为分析纯。台式液成分（）：、，用 调节 值至。无钙台式液中不含 ，含钙台式液为台式液中加入 。细胞贮存液（液，）：、，用 调节 值至。细胞分离液成分（）：、，用 调节 值至；无钙分离液为分离液中增加 但不加入 。记录 的细胞外液成分（）：同细胞分离液。在细胞外液中加入 阻断短暂外向钾电流（）。记录 的细胞内液成分（）：、，用 调节 值至。过 表 达 及 沉 默 慢 病 毒 载 体 构 建 过表达和 干扰慢病毒载体构建：委托上海吉凯基因化学技术有限公司构建 过表达和 干扰慢病毒载体。过表达载体信息 为：；干 扰 载 体 信 息 为 。细胞培养与慢病毒感染细胞（心房细胞株购自华拓生物科技有限公司）。培养前，将明胶纤连蛋白混合液加到细胞培养瓶，、细胞培养箱中孵育过夜，接种细胞前将明胶溶液移除。将 细胞接种到明胶预包被的 细胞培养瓶中，放入、细胞培养箱中培养，每 更换次培养液。当细胞达到 融合时，用含有 的新鲜完全培养液替换原 培 养 基。根 据 前 期 预 实 验 确 定 的 感 染 复 数（，），加入 含 病毒悬液，依据病毒载体不同分为四组：过表达慢病毒载体（）组、对照 载 体（）组；干 扰 慢 病 毒 载 体（）组、对 照 载 体（）组。将细胞放回培养箱继续培养。后换液，用新鲜完全培养液替换含有病毒的培养液。转染 后，使用荧光显微镜观察慢病毒荧光在细胞中的表达情况，感染阳性的细胞用于进一步实验。对细胞端粒的影响运用定量荧光原位杂交（）方法测定端粒长度：参照文献，取 细胞，离心加入冰醋酸固定溶液调整细胞浓度为 个，将一滴细胞固定悬液置于干燥载玻片，孵育，浸洗；多聚甲醛处理后，冰乙醇梯度脱水晾干；端粒特异性探针 （）（公司）避光室温杂交，洗去探针，以含有 的封片剂封片。激光共聚焦显微镜扫描成像，采用图像分析软件 分析观察荧光强度。利用已知端粒长度的标准细胞系，获待测细胞的端粒长度的半定量结果。细胞生长曲线绘制细胞达 融合时，胰蛋白酶 消化细胞并制成悬液，细胞计数板计数。按 个孔接种于 孔板中，每组设置个复孔；细胞贴壁后，每孔加入 细胞计数试剂盒（，）中 试剂 此试剂是基于 （水溶性四唑盐，化学名：（甲氧基硝苯基）（硝苯基）（，二磺基苯）四唑单钠盐）研发应用于细逆转录酶基因过表达或沉默对细胞钠电流的作用胞增殖的检测；孵育，用酶标仪测定各孔在 处的 值，并记录；每 用酶标仪测定并记录，以时间为横轴，值为纵轴绘制细胞生长曲线。电流的记录条件在电压钳制模式下，采用全细胞膜片钳技术记录离子流。首先，将 膜片钳放大器（，）连接到计算机。应用 数模转换器（，）进行刺激信号及电压输入信号的采集。用 微电极拉制仪（）将 玻璃毛坯拉制成尖端内径为，入液后电阻为的电极。通过调节三维操纵器，使玻璃微电极逐步接近细胞，然后采用负压方式抽吸至形成高阻抗封接。当封接电阻达 以上时，在采用吸附脉冲方式将细胞膜打破，最终形成全细胞记录模式。将刺激参数设置为进行细胞膜电容的测定，电流则按 （）方程来计算（其中 为膜电容，为电流值，为电压斜率）。刺激参数设置 的记录：在电流钳模式下，保持电位，施予 ，的去极化脉冲。的电流电压（）曲线：在电压钳模式下，保持电位 ，施予 ，阶跃 ，的去极化脉冲，记录各电压下。的稳态激活曲线：保持电位 ，施予 ，的去极化脉冲，阶跃为，记。将电流标准化，以各电压下的刺激脉冲为横轴，以标准化电流为纵轴作图。的稳态失活曲线：保持电位 ，施予 ，阶跃，的快速脉冲，紧接着在每一条件脉冲后紧跟一固定去极化至，的测试脉冲，记录。的关闭态失活曲线：采用双刺激模式，钳制电位为，在刺激电位，给予、等不同时间，然后阶跃到，记录电流，决定通道在与刺激期间的可利用性。的中间态失活曲线：采用双刺激模型引出，钳制电位为，施予，、不同时间的刺激，恢复至 ，间隔 ，再给予，刺激，记录电流。的失活后恢复曲线：采用双脉冲刺激法，电压钳制在 ，条件脉冲和测试脉冲均为，两次脉冲之间的 间隔时间逐渐递增（、），将测试脉冲的 与条件脉冲的 之比对相应的时间间隔绘制曲线。数据处理计量资料以?表示。原始图记录与信息采集通过软件（）完成，钠离子通道的稳态激活及稳态失活曲线进行 方程 （）拟合，通道的关闭态失活、中间态失活和失活后恢复曲线则采用用单项指数式 （）进行拟合，所有数据经 软件处理，绘制 各 种 曲 线 图 并 求 算 参 数。用 统 计 分 析 软 件 进行数据分析。以 为差异有显著性。结果四组端粒长度和细胞生长的比较 组细胞端粒长度明显延长，从 延长至 （，），组显示端粒长度缩短为 （，）。与 组相比，组 细胞增殖能力明显增强，而与 组相比，组则导致细胞增殖能力显著减弱，见图。与 组比较，；与 组比较，图四组生长曲线的比较四组 电流幅值和电流密度的比较 组 细胞 电流幅值显著增加，而 组 改变恰好相反，见图。在 去极化时，与 组比较，组 细胞 电流密度从（）增至（）（，）。而与 组比较，组 电流密度从（）降至（）（，）。中国心脏起搏与心电生理杂志 年第 卷第期图四组 电流幅值的比较四组 曲线的比较 曲线的最大峰值电位约在。组在 范围内，电流增加，且越靠近峰值，增加越明显。而与 组相比，组 电流密度均降低，此效应在 范围内更加明显，见图。四组 稳态激活的比较与 组对比，组 的半激活电压和稳态激活曲线斜率变化不明显，而与 组相比，组 的半激活电压右移（，），见图。四组 稳态失活曲线的比较 组 稳态失活曲线右移，半失活电压（，）从（：四组串刺激诱发 原始记录图；：四组 曲线。与 组比较，；与 组比较，图四组 及其曲线的比较图四组 稳态激活曲线的比较）移至（）（，）。而 组 稳态失活曲线向超极化方向移动，半失活电压（，）从（）移至（）（，）；且稳态失活曲线斜率增加，从增加至（，）。见图。四组 电流关闭态失活和中间态失活动力学的比较与 组，组 比较，组，组 中间态失活过程和失活时间常数影响不明显，见图。但与 组相比，组失活时间常数延长，其值分别为（）（）（，）。而 组失活时间常数缩短明显，其值分别为（）（）（，），见图。四组 失活后恢复动力学的比较 组 失活后恢复动力学过程加速，而 组通道失活后恢复曲线右移，恢复时间延长，进而降低有效通道数量，降低电流密度，见图。逆转录酶基因过表达或沉默对细胞钠电流的作用：四组 稳态失活曲线的原始记录图；：四组 稳态失活曲线图四组 稳态失活曲线的比较：四组 中间态失活过程的原始记录图；：四组 中间态失活曲线图四组 中间态失活动力学的比较讨论本研究发现，基因的慢病毒转染 细胞端粒长度增加，而沉默 基因后 细胞的端粒长度缩短，说明 基因改变或干预对细 胞 上 的 端 粒 长 度 有 直 接 影 响。进 一 步，促进 细胞增殖。众所周知，端粒酶可延缓生长停滞、衰老并防止细胞死亡，还可能参与对抗机械和氧化应激，在坏死和炎症过程中，氧化应激随着活性氧的增加而增加。正常情况下，缺乏端粒酶的细胞一旦端粒长度降至某个阈值以下，便会进入衰老的非增殖状态，可引起全身多器官的衰老化。等通过培养 小鼠原代成纤维细胞，发现与野生型细胞相比，端粒酶敲除的细胞表现端粒长度缩短，细胞更快衰老。等将带有人 基因的慢病毒转染到树突细胞中，观察到了端粒的延长，并增加细胞的作用。的相关研究报道支持本研究的实验结果，端粒缩短是细胞衰老和寿命调节的分子机制之一，为治疗年龄相关疾病（如房颤）提供了潜在的治疗策略。在本研究中，笔者发现 基因的慢病毒转染细胞后，细胞的 密度明显增加。中国心脏起搏与心电生理杂志 年第 卷第期：四组 关闭态失活过程的原始记录图；：四组 关闭态失活曲线图四组 关闭态失活动力学的比较：四组 失活后恢复过程的原始记录图；：四组 失活后恢复曲线图四组 失活后恢复动力学的比较这一发现提示 基因在影响细胞端粒长度和增殖的前提下，对该细胞膜上 也有直接影响。钠通道由 基因编码的亚基（），是心脏中的主要元件，在心肌细胞的兴奋性中起关键作用。生理条件下，从失活中恢复的过程发生在舒张期的复极阶段。动作电位和传导的上行速度由可打开的钠通道的数量决定，钠通道打开数量多，则 传 导 的 上 行 速 度 快，反 之，上 升 的 速 度慢。研究显示，异常可通过影响动作电位最大上升速率和心房有效不应期，降低传导储备和频率适应性，引起传导障碍，利于多子波折返形成 。因此，笔者推测 可能通过改变心房肌细胞的，影响心房的传导过程，从而可能诱发房颤的发生。对钠通道门控机制研究发现，过表达 使 稳态失活曲线右移，说明在相同去极化电压下，钠离子通道稳态失活减少，有效通道数增加；而过表达 后，钠通道关闭态失活时间常数延长，失活后恢复时间常数缩短，基于此，此时钠通道在关闭态的失活相对较少，且从失活状态恢复过程加速，使得 迅速增加 。反之，沉默 基因的效应恰好相反，这说明上述三个过程可能是逆转录酶基因过表达或沉默对细胞钠电流的作用 影响 密度的主要原因。而笔者的研究发现，虽然通道的稳态激活曲线斜率有所改变，但过表达或沉默 对钠通道稳态激活和中间态失活影响均不大。本研究采用的是心肌细胞系，其衍生于小鼠心房肌细胞肿瘤谱系，可稳定快速增殖，保持心脏形态学和生化特性，且与成人心房肌细胞有相似的基因表达模式。细胞作为永生的收缩性心肌细胞系，获取容易且稳定，表达产生原代心肌细胞的特征性动作电位所需的离子通道，广泛应用于心脏生理学、病理生理学及药理学研究。基于此，本实验选用 心肌细胞系研究 过表达或沉默对 的作用，可提高慢病毒的感染效率，同时避免了慢病毒细胞毒性对原代心房肌细胞的影响。本研究虽然采用细胞在一定程度上很好反应心房肌细胞，但并未应