内生拮抗细菌对草莓2种病原真菌的抑制作用_张莉.pdf

27Wei Y H，Xiong S P，Zhang Z Y，et alLocalization，geneexpression，and functions of glutamine synthetase isozymes in wheatgrain(Triticum aestivum L)JFrontiers in Plant Science，2021，12:580405 28Imran M，Hu C X，Hussain S，et al Molybdenum induced effectson photosynthetic efficacy of winter wheat(Triticum aestivum L)underdifferentnitrogensourcesareassociatedwithnitrogenassimilationJ Plant Physiology and Biochemistry，2019，141:154 163 29Fernando K M C，Ehoche O G，Atkinson J A，et al Root systemarchitecture and nitrogen uptake efficiency of wheat speciesJ Journal of Agricultural Sciences，2021，16(1):37 53 30 郭志强，范佳利，朱立勋，等 小麦 NRT1 基因家族鉴定、表达与DNA 变异分析J/OL 分子植物育种(2021 10 15)2022 09 11 http:/kns cnki net/kcms/detail/46 1068 s20211014 html 31 Imran M，Sun X C，Hussain S，et al Molybdenum supply increasesroot system growth of winter wheat by enhancing nitric oxideaccumulation and expression of NRT genesJ Plant and Soil，2021，459(1):235 248 32 李晨阳，孔祥强，董合忠 植物吸收转运硝态氮及其信号调控研究进展 J 核农学报，2020，34(5):982 993张莉，张博源，陈思乐，等 内生拮抗细菌对草莓 2 种病原真菌的抑制作用J 江苏农业科学，2023，51(4):121 127doi:10 15889/j issn1002 1302 2023 04018内生拮抗细菌对草莓内生拮抗细菌对草莓 2 2 种病原真菌的抑制作用种病原真菌的抑制作用张莉1，3，张博源1，陈思乐1，刘猛1，潘威霖1，蒲一蕾1，惠明1，3，谢辉2(1 河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001;2 河南省蚕业科学研究院，河南郑州 450001;3 工业微生物菌种保藏与选育河南省工程实验室，河南郑州 450001)摘要:从草莓健康植株中分离得到 9 株内生细菌，与灰葡萄孢菌和腐皮镰刀菌进行对峙试验，选出对这 2 种病原真菌有明显拮抗作用的 2 种菌株 BS CM511 2 和 BA CM11 1。通过形态及 16S rRNA 序列鉴定可知，菌株 BS CM511 2 为枯草芽孢杆(Bacillus subtilis)，菌株 BA CM11 1 为解淀粉芽孢杆菌(B amyloliquefaciens)。BA CM11 1 和 BS CM511 2 这2 株内生拮抗菌能够显著抑制灰葡萄孢菌和腐皮镰刀菌的生长，抑菌半径分别为36.0、27.0、30 3、24 3 mm。这 2 株拮抗内生菌无菌发酵液稀释 10 倍下对灰葡萄孢菌孢子萌发的抑制率分别达到 81 75%和 88 80%，稀释 5 倍下对腐皮镰刀菌孢子萌发的抑制率分别达到 60 80%和 69 20%，枯草芽孢杆菌发酵液稀释 10倍对灰葡萄孢菌的抑制效果较好，枯草芽孢杆菌发酵液稀释 5 倍对腐皮镰刀菌抑制效果较好，这 2 株内生菌可作为生防资源应用于草莓病害的防治。关键词:内生菌;灰葡萄孢菌;腐皮镰刀菌;拮抗;抑制作用;生防资源中图分类号:S182;S436 68+4文献标志码:A文章编号:1002 1302(2023)04 0121 07收稿日期:2022 03 02基金项目:河南省重点研发和推广专项(编号:222102110308);河南工业大学青年骨干教师培育计划(编号:21420168);河南省蚕业科学研究院基础科研项目。作者简介:张莉(1983)，女，河南周口人，博士，副教授，从事植物与微生物互作方面的研究。E mail:zhanglibio haut edu cn。通信作者:谢辉，硕士，农艺师，从事微生物与蚕桑方面的研究。E mail:781682713 qq com。灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)是半知菌亚门病原菌，寄主范围相当广泛，其菌丝、孢子和菌核都可以侵染多种植物，对于宿主具有致死性，尤其容易感染瓜类、浆果类和茄果类等果蔬作物，是限制果蔬品质和产量提高的重要因素之一1。镰刀菌属(Fusarium spp)是一类分布广泛的真菌，其致病性广，致病力强，使植物表现出萎蔫、腐烂、坏死等症状。张阳等研究发现，木贼镰刀菌、尖孢镰刀菌和茄腐镰孢菌均可造成草莓根腐病的发生2。在美洲、欧洲、澳洲和亚洲的部分区域都发现尖孢镰刀菌(F oxysporum)和腐皮镰孢菌(F solani)侵染草莓植株，而引起根腐病的报道，镰刀菌属病原菌已成为防治草莓根腐病中最棘手的病原种类3。目前主要在植物叶面喷洒化学药剂防控植物真菌病害，化学方法抑制病害效果较好，但易使病原菌产生高抗药性，防治效果逐渐减弱4。生物防治主要利用细菌、真菌、放线菌等微生物，其新陈代谢产生的拮抗物质、促生物质和占据空间可以抑制病原菌的生长，因此不宜使病原菌产生耐药性，不会造成环境污染，有利于保持生态平衡。地衣芽孢121江苏农业科学2023 年第 51 卷第 4 期杆菌(Bacillus licheniformis)、格氏沙雷菌(Serratiagrimesii)、绿针假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和丁香假单胞菌(P syringae)都能显著抑制灰葡萄孢菌的菌丝生长和分生孢子萌发5 8。近年来，研究者分离出许多对病原真菌具有良好拮抗效果的植物内生菌4，如从樱桃中分离得到的内生特基拉芽孢杆菌(B tequilensis)TY 69，从番茄内生菌中筛选出的贝莱斯芽孢杆菌(B velezensis)10。荧光假单胞菌(P fruorescnes)、从枝菌根菌(arbuscularmycorrhiza)、枝芽孢菌属(Virgibacillus)、白黑链霉菌(Salboniger)和 白 刺 链 霉 菌(Streptomycesalbospinus)等许多微生物被证实对草莓根腐病病原菌和灰霉菌有拮抗作用11 13。植物内生菌是从健康植株中分离出来的菌株，在植物体内具有稳定的生存空间，不对宿主产生明显的病害，而且可以产生多种抗菌活性物质，可以与植物病原体进行相互竞争获得一种有利于自身发展和繁殖的因子，从而提高植物宿主对于这些病原体的抵御能力，是很有潜力的生物预防资源14。目前，对于植物内生菌拮抗灰霉病病菌和根腐病病菌的研究已有报道6 7，但拮抗灰葡萄孢菌和腐皮镰刀菌的草莓内生菌鲜见报道。本研究从草莓植株中分离出内生菌，筛选出对灰葡萄孢菌具有良好抑制拮抗效果的菌株，并对抑菌效果进行初步研究。1材料与方法1 1供试材料1 1 1供试菌种草莓内生菌从草莓健康植株上分离获得;草莓灰葡萄孢菌从草莓果实上分离获得，腐皮镰刀菌从发病草莓植株根部分离获得。1 1 2培养基PDA 培养基、PDB 培养基、LB 培养基和孟加拉红培养基，均在 121 条件下高压灭菌 20 min 后使用。1 2试验方法1 2 1内生菌的形态观察将草莓内生菌采用平板划线法在 LB 固体培养基上得单菌落，观察记录在培养基平板上的生长状况、菌落颜色及特征。培养3 5 d 后，进行细菌革兰氏染色，在显微镜下观察菌落形态、大小和颜色，从而初步对拮抗菌进行分类。1 2 2灰葡萄孢菌孢子悬液的制备将灰葡萄孢菌接入 PDA 培养基，28 培养 5 7 d，取菌丝和孢子放入无菌水中，过滤去除菌丝，制备孢子悬液，采用血球计数法调整悬液中孢子浓度为 107CFU/mL，分装备用15。1 2 3拮抗细菌的筛选与拮抗能力的测定12 3 1拮抗细菌的筛选以灰葡萄孢菌和腐皮镰刀菌为靶标真菌，采用传统的三点对峙培养法，挑取 PDA 平板上扩大培养的病原菌的菌丝接种于PDA 培养基正中间，在距中心等距离处接种待筛选的菌株，以无菌水作为对照，28 恒温培养 4 5 d，观察内生菌对病原菌的抑制情况，每个菌种重复2 3 次。12 3 2拮抗菌株的拮抗性能测定采用两点平板对峙法，对初筛有效果的细菌进行复筛。在直径为 90 mm 的装有 PDA 培养基培养皿背面任意画 2条直径，在距离圆心 2 5 cm 的位置接种直径为8 mm 的病原菌菌饼，在对称的另一侧相同距离处点接细菌。对照组在病原菌菌饼的对称侧点接无菌水。28 培养 3 5 d，监测生长情况。对照组真菌菌落边缘至真菌中心位置的距离为 R1;试验组真菌菌落边缘至真菌中心位置的距离为 R2;真菌菌落边缘至相邻细菌菌落边缘距离为 R3，即抑菌半径。抑菌率按照公式(1)计算:抑菌率=R1 R2R1100%。(1)1 2 3 3拮抗菌无菌发酵滤液的抑菌活性测定16 取拮抗菌接种于 PDB 培养基中，28、180 r/min培养 48 h，之后12 000 r/min 离心20 min，收集上清液，分别用孔径为 0 22、0 45 m 的滤膜过滤，得到无菌发酵液。用 55 左右的 PDA 培养基把上述发酵液稀释 10、20 倍，之后倒平板。用添加同体积无菌水的 PDA 培养基为对照。吸取 10 mL 无菌发酵液加入90 mL PDA 培养基，每个平板倒入约25 mL，分 4 个平板。培养基凝固后，在中心接入直径为8 mm 的灰葡萄孢菌块，28 恒温培养。对照平板菌丝到菌落中心距离为 RO，对不同处理中病原菌的菌落直径(R1)进行测量。采用公式(2)计算抑菌率。抑菌率=RO R1RO100%。(2)1 2 3 4拮抗菌无菌发酵液对孢子活性的影响萌发率计算:孢子悬浮液每隔 6 h 观察 1 次，在 12 h后观察并记录每个处理组的孢子悬浮液中孢子的萌发率，取血球计数板，每个玻片在物镜 40 放大倍数下，随机选取 5 个不同的视野，记录孢子总数和孢子萌发数，孢子萌发出的菌丝长度超过孢子长度221江苏农业科学2023 年第 51 卷第 4 期的 1/2 记为已萌发。每个处理组选取的 5 个视野的平均值与对照组 106CFU/mL 浓度的孢子悬液在所选视野中的孢子萌发数与孢子总数的比值即为该处理组的孢子萌发率，并根据公式(3)、公式(4)计算发酵液对病原菌孢子的萌发抑制率17。萌发率=孢子萌发数孢子总数100%;(3)抑制率=对照组孢子萌发率 发酵液处理孢子萌发率对照组孢子萌发率100%。(4)1 2 416S rRNA 的 PCR 扩增和序列分析选取通用引物 16S 27F(5 AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3);16S 1492R(5 GGYTACCTTGTTACGACTT3)进行 PCR 扩增。扩增产物回收、测序并进行同 源 性 比 较，利 用 MEGA X 软 件 用 邻 接 法neighbour joining 构建16S rRNA 系统发育树分析。2结果与分析21内生细菌形态学特征的鉴定对草莓9 株内生细菌进行初步鉴定，从菌落形态可以看出，这9 种菌落颜色为白色或乳白色，不透明，圆形，光滑或不规则，大部分属于革兰氏阳性杆菌(图1)，只有菌株 AJ CM321 1 属于革兰氏阴性杆菌，无芽孢，而属于革兰氏阳性杆菌的除菌株 CO