南海A油田硫酸盐还原菌群落组成分析_张世仑.pdf

第 1 期第 53 卷基金项目：国家自然科学基金项目“面向海上聚驱采出水的油滴-微泡团聚机理及其协同动态旋流预除油特性研究”（项目编号U20B2030）*通信作者：张世仑（1984），男，工程师，博士，研究方向：化学驱、微生物采油等三次采油技术研究。E-mail：。南海 A 油田硫酸盐还原菌群落组成分析张世仑1,2*，王大威1,2，黄波1,2，靖波1,2，王秀军1,21.海洋石油高效开发国家重点实验室，北京 100028；2.中海油研究总院有限责任公司，北京 100028摘要：文章的主要目的是探究南海高温 A 油田油藏酸蚀的生物学成因，对油藏内源硫酸盐还原菌（sulfate-reducing bacteria，SRB）进行定量分析，同时借助高通量测序技术对 SRB 群落的组成进行分析。从而证实了在高温油田中 SRB 的增殖代谢活动，能为治理海上高温油田硫酸盐还原反应引起的酸蚀问题提供依据和指导。关键词：酸蚀；硫酸盐还原菌；定量分析；高通量测序；群落组成；石油doi：10.3969/j.issn.1001-6678.2023.01.029在注水开发的油藏系统中已经分离或检测到了多种不同生理功能的微生物，主要包括好氧菌、硫酸盐还原菌（sulfate-reducing bacteria，SRB）、硝酸盐还原菌、铁还原菌、发酵菌和产甲烷菌1-3。其中，SRB是一类原核微生物，包括细菌和古生菌，它们能够在能量代谢的过程中利用硫酸盐作为最终的电子受体生成 H2S4，引起油藏酸蚀，导致一系列严重的环境及生产问题。有研究表明，生命起源早期就已出现了能够还原硫酸盐中的嗜热古菌和细菌，例如闪烁古球菌（Archaeoglobus fulgidus）、深海古球菌（Archaeoglobusprofundus）和热球菌（Thermococcus）等5。在硫酸盐被还原为 H2S 的过程中，ATP 与硫酸盐在 ATP 硫酸化酶的催化下生成了腺苷酰硫酸（APS），APS 还原酶（APR）将 APS 还原成亚硫酸盐，而亚硫酸盐会在异化型亚硫酸盐还原酶（DSR）的作用下，产生硫化物6。鉴别油藏环境中特定功能的微生物群落结构对于分析内源菌群的酸蚀作用是十分必要的。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种来源南海高温 A油田 X区块（油藏温度为 6375，埋深为 1 1001 400 m）注水井 X1 水样、生产井 X2采出液。1.1.2试剂及仪器设备ABIGeneAmp9700PCR仪（AppliedBiosystems，美国）、AxyPrep 细菌基因组 DNA 试剂盒（AxygenBiosciences，美国）、Bestar SybrGreen qPCR 反应混合物（DBI Bioscience，德国）、CFX96 实时荧光定量PCR 仪（Bio-Rad，美国）、EmeraldAmp PCR 反应混合物（Takara Bio，日本）、Illumina Miseq 测序平台（武汉明泰生物技术有限公司，中国）、电感耦合等离子发射光谱仪 SpectroBlue（Spectro，德国）、离子色谱仪ICS-1100（Thermo Fisher，美国）。1.2方法1.2.1采集油田样品取 25 L 塑料桶，用 95%酒精洗 3 遍；视井口压力的高低选择性地接上取样器，开启取样阀，让产出液流出 10 min 并冲洗塑料桶 3 遍；将产出液装满塑料桶，每口井的原油不少于 1 L，地层水不少于 10 L，拧紧盖子，密闭常温保存；采集样品后，尽快运输到实验室进行处理。1.2.2离子参数检测将样品离心 5 min（12 000 r/min），取中层清液过 0.22 m 滤膜，回收滤液，分别用离子色谱仪、电第 53 卷第 1 期2023 年 2 月工业微生物Industrial MicrobiologyVol.53 No.1Feb.202395-第 1 期第 53 卷工业微生物井号K+Na+Ca2+Mg2+Fe2+、Fe3+Cl-SO42-X1548.9 12 447.5229.520.51.620 473.1250.0X2168.6 12 479.6128.342.90.220 476.316.0感耦合等离子发射光谱仪检测滤液中阴、阳离子的含量。1.2.3菌体收集对样品的水相部分，采用离心法（12 000 r/min，5 min）收集其中的菌体；对油相部分，先与异辛烷混合，待充分溶解后，再将得到的单一相进行离心 20min（12 000 r/min）并收集沉淀；将上层液相过 0.22m 滤膜，收集菌体。1.2.4DNA 提取将 20 mL 菌液置于离心管内，12 000 r/min 离心10 min；菌体沉淀用 1 mL Lysis buffer 洗 2 次，再用0.6 mL Lysis buffer 重悬后，放入 0.2 g 玻璃珠，研磨1 min，重复 3 次，随后加入浓度 10 mg/mL 的溶菌酶，在 37 的条件下，反应 1 h；加入 120 L 20%SDS，在 65 的条件下，反应 1 h；用 AxyPrep 细菌基因组 DNA 试剂盒进行后续提取工作，操作步骤严格参照说明书。1.2.5群落组成分析采用通用引物515F（5-GTGCCAGCMGCCGCGG-3）、907R（5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3）对样品 DNA 进行 16S rRNA 基因扩增7，反应体系（ddH2O 12 L，2Taq PCR Master Mix 10 L，正反向引物各 1 L，DNA 1 L），反应程序（预变性 95，5 min；35 个循环：变性 95，30 s；退火 52，30 s；延伸 72，1 min；终延伸 72，10 min）；扩增产物送至武汉明泰生物技术有限公司进行微生物群落组成和多样性分析。1.2.6菌群定量分析微生物总数及 SRB 的定量是分别基于前述16S rRNA 基因通用引物和硫酸盐还原功能基因引物aprAF(5-TGGCAGATCATGATYMAYGG-3)、aprAR(5-GCGCCAACNGGDCCRTA-3）8对样品DNA 进行扩增，反应体系（ddH2O 12 L，2TaqPCR Master Mix 10 L，正反向引物各 1 L，DNA 1L），反应程序（预变性 95，50 s；45 个循环：变性95，5 s；退火 55，40 s；延伸 72，1 min；终延伸 95，5 s）。标准曲线的建立是基于一系列十倍梯度稀释的携带目标基因的质粒。在扩增曲线上读取 Ct 值，通过标准曲线进行换算可知样品中目标菌群的数量。1.2.7国际基因库测序接受号样品高通量测序数据已经上传至 NCBI SRA（Sequence Read Archive）数 据 库，接 受 号 为PRJNA850637。2结果与分析2.1离子参数分析由表 1 可知，注水井 X1 中 SO42-的质量浓度为250.0 mg/L，而在生产井 X2 采出液中，SO42-的质量浓度为 16.0 mg/L，SO42-的浓度下降了一个数量级。这说明从注入端到产出端，SO42-在 SRB 介导的硫酸盐还原过程中作为电子受体，被大量消耗。表 1单井样品的离子浓度（单位：mg/L）2.2微生物群落组成分析选择 16S rRNA 基因测序所得 OTU 代表序列，比对 NCBI 数据库，获得菌种的注释信息。基于注释信息，计算各菌种的相对丰度，生成油田内源微生物的相对丰度分布图（图 1）。一方面，有 6 大门类微生物的丰度较高，分别是 Proteobacteria（变形菌门）、Actinobacteria（放线菌门）、Thermotogae（热袍菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）、Euryarchaeota（广古菌门）和Thermodesulfobacteria（热脱硫杆菌门）。其中，占比最高的是 Proteobacteria，在注水井 X1 中达到 97.01%，生产井 X2 中达到 97.04%，已知的绝大多数SRB属于 变 形 菌 门。此 外，Thermodesulfobacteria 和Thermotogae 属于嗜热型微生物，显示了高温油田的特征，且前者也是一类 SRB。另一方面，如图2所示，在属水平，包含8种SRB，分别是 Desulfobacter(脱硫杆菌属)、Desulfococcus（脱硫球菌属）、Desulfovibrio（脱硫弧菌属）、Desulfomicrobium（脱硫微杆菌属）、Desulfotomaculum（脱硫肠状菌属）、Thermodesulfobacterium（高温脱硫杆菌属）、Thermococcus（热球菌属）和 Archaeoglobus（古生球菌属）。这些 SRB 在注水井 X1 水样菌群中的总占比为 0.18%，在生产井 X2 采出液中的总占比提升至0.21%，这说明从注入端到产出端，经过地层高温环境的孵育，SRB 菌群呈现出增殖趋势，其中以96-第 1 期第 53 卷张世仑等：南海 A 油田硫酸盐还原菌群落组成分析Desulfovibrio 的增幅最大，占比由 0.08%增加为0.11%。图 1微生物的相对丰度分布图（纵坐标为样本名，X1 为注水井，X2 为生产井；横坐标为菌种在样本中所占的比例）图 2目标井硫酸盐还原菌丰度对比（X1 为注水井，X2 为生产井；纵坐标为菌种名，横坐标为菌种在样本中所占的比例）2.3菌群定量分析基于 16S rRNA 基因、硫酸盐还原功能基因aprA 分别对样品中的微生物总量（total microbes，TM）和 SRB 进行定量分析。如图 3 所示，在注水井X1 水样中，微生物的总量达到 2.53106个/mL，其中，SRB 的含量为 3.94103个/mL，占总菌量的0.16%。而在生产井 X2 采出液中，微生物的总量上升至 3.85107个/mL，相比于注水端，增加了 10 倍以上；同样地，X2 井中的 SRB 含量也增加了 10 倍以上，达到 7.57104个/mL，占总菌量的 0.20%。可见，经过高温油藏的温育，内源微生物、SRB 均得到了显著的增殖，且 SRB 在总菌的占比与前述高通量测序的趋势相一致。3讨论目前，已经检测到超过 220 种（60 个属）SRB，主要属于 6 个门类，包括变形菌门（Proteobacteria）、消化螺旋菌门（Nitrospira）、厚壁菌门（Firmicutes）、热脱硫杆菌门（Thermodesulfobacteria）、广古菌门（Euryarchaeota）和泉古菌门（Crenarchaeota）9-10。图 2中，属于-变形菌门（Delta-proteobacteria）的Desulfovibrio 和 Desulfomicrobium 是嗜温型 SRB，能够利用氢气、乳酸和丙酮酸为电子供体。Desulfobacter 和Desulfococcus 可以氧化脂肪酸，并将硫酸盐还原为单质硫。有研究发现，在腐蚀严重的海上油田采油系统的生物膜中，是以 Desulfovibrio 为主11，图 2 也显示了由注入端至产出端，Desulfovibrio 丰度的增幅最为显著。Desulfotomaculum（属于厚壁菌门）和Thermodesulfobacterium（属于热脱硫杆菌门）都是嗜热型 SRB，多存在于高温油藏中9。从油田中分离出来的硫酸盐还原古菌只有属于广古菌门的极端嗜热菌 Archaeoglobus12，通过宏基因组测序分析Archaeoglobus fulgidus 表明，它能以硫酸盐和硫代硫酸盐为电子受体而利用脂肪酸13。微生物的种类不同，其代谢所产生的有机酸也会存在差异，有机酸种类的不同是造成腐蚀行为差异性的关键因素14。不同优势菌种组成的 SRB 群落，对其治理工艺中的药剂具有不同的敏感性，也就会影响各种药剂的杀菌效果。对目标油藏中 SRB 群落结构的全面分析，有助于指导杀菌剂的精确选用和治理工艺的精细调控，这就需要利用分子生物