耐受性树突状细胞在胶原蛋白...关节炎大鼠体内形成微嵌合体_包伦敏.pdf

论论著著文文章章编编号号：（）耐耐受受性性树树突突状状细细胞胞在在胶胶原原蛋蛋白白诱诱导导性性关关节节炎炎大大鼠鼠体体内内形形成成微微嵌嵌合合体体包包伦伦敏敏，马马贵贵兰兰，龙龙调调玉玉，蒋蒋红红梅梅（贵贵州州医医科科大大学学医医学学检检验验学学院院临临床床微微生生物物学学及及免免疫疫学学教教研研室室，贵贵州州 贵贵阳阳 ；安安顺顺市市人人民民医医院院检检验验科科，贵贵州州 安安顺顺 ）收收稿稿日日期期：；接接受受日日期期：基基金金项项目目：国国家家自自然然科科学学基基金金地地区区科科学学基基金金（）；贵贵州州省省普普通通本本科科高高校校自自然然科科学学研研究究创创新新群群体体项项目目（黔黔教教合合 字字 ）作作者者简简介介：包包伦伦敏敏（），男男，湖湖南南龙龙山山人人，中中级级检检验验师师，硕硕士士研研究究生生 ：；：通通讯讯作作者者，蒋蒋红红梅梅，：摘摘 要要 目目的的 寻寻找找耐耐受受性性树树突突状状细细胞胞（）输输注注到到胶胶原原蛋蛋白白诱诱导导关关节节炎炎（）模模型型大大鼠鼠后后形形成成微微嵌嵌合合体体的的证证据据。方方法法 骨骨髓髓来来源源的的 前前体体细细胞胞经经粒粒细细胞胞 巨巨噬噬细细胞胞集集落落刺刺激激因因子子（）、白白细细胞胞介介素素 （）及及核核因因子子 寡寡核核苷苷酸酸诱诱骗骗剂剂（）诱诱导导成成 ，再再用用，十十八八烷烷基基 ，四四甲甲基基三三碳碳氰氰基基碘碘化化物物（）标标记记后后输输注注到到 大大鼠鼠体体内内。在在细细胞胞输输注注的的第第 、，用用小小动动物物活活体体成成像像系系统统观观察察荧荧光光强强度度和和分分布布，第第 天天处处死死大大鼠鼠，检检测测主主要要脏脏器器荧荧光光信信号号。结结果果 高高表表达达 ，低低表表达达 和和 。荧荧光光信信号号主主要要集集中中在在胸胸腹腹部部和和左左后后关关节节，胸胸腹腹部部荧荧光光信信号号在在 最最强强，左左后后关关节节荧荧光光信信号号在在 最最强强。在在细细胞胞输输注注的的 仍仍能能检检测测到到荧荧光光，并并且且病病足足左左后后关关节节始始终终保保持持较较强强荧荧光光信信号号。离离体体器器官官肺肺、肝肝、脾脾、肠肠系系膜膜淋淋巴巴结结中中荧荧光光信信号号较较强强，肾肾荧荧光光信信号号较较弱弱，心心脏脏几几乎乎没没有有荧荧光光。结结论论 在在病病足足关关节节、肺肺、肝肝、脾脾、肠肠系系膜膜淋淋巴巴结结形形成成微微嵌嵌合合体体。关关键键词词 耐耐受受性性树树突突状状细细胞胞（）；胶胶原原蛋蛋白白诱诱导导性性关关节节炎炎（）；微微嵌嵌合合；类类风风湿湿性性关关节节炎炎（）中中图图分分类类号号 ，文文献献标标志志码码 ，；，：（）（）（），（）（），（），；类类风风湿湿性性关关节节炎炎（，）是是一一种种慢慢性性自自身身免免疫疫性性疾疾病病，目目前前无无特特效效疗疗法法 。传传统统的的 治治疗疗药药物物无无法法根根治治疾疾病病，仅仅能能改改善善炎炎症症和和减减缓缓疾疾病病进进程程，如如非非甾甾体体类类抗抗炎炎药药（细胞与分子免疫学杂志（），（）DOI:10.13423/ki.cjcmi.009477 ，）、改改 善善 病病 情情 抗抗 风风 湿湿 药药（，）、糖糖皮皮质质激激素素、生生物物药药物物等等，尽尽管管这这些些药药物物有有一一定定的的疗疗效效，但但由由于于存存在在明明显显的的副副作作用用，如如胃胃肠肠道道损损伤伤、心心脏脏并并发发症症、免免疫疫抑抑制制导导致致的的机机会会性性感感染染，其其使使用用受受到到限限制制 。近近年年来来，耐耐受受性性树树突突状状细细胞胞（，）被被尝尝试试用用于于治治疗疗 等等自自身身免免疫疫性性疾疾病病，显显示示了了良良好好效效果果，有有望望成成为为治治疗疗 的的新新手手段段 。表表达达低低水水平平的的共共刺刺激激分分子子，产产生生免免疫疫调调节节细细胞胞因因子子，并并抑抑制制 细细胞胞增增殖殖活活化化，在在诱诱导导自自身身免免疫疫耐耐受受方方面面有有重重要要作作用用 。前前期期研研究究中中，我我们们用用 寡寡核核苷苷酸酸诱诱骗骗剂剂（，）和和 牛牛 型型 胶胶 原原 蛋蛋 白白（，）处处理理树树突突状状细细胞胞（，），成成功功获获得得了了高高纯纯度度抗抗原原特特异异性性 ，将将之之输输注注到到胶胶原原蛋蛋白白诱诱导导性性关关节节炎炎（，）大大鼠鼠体体内内，观观察察到到良良好好干干预预效效果果 。然然而而，对对 的的干干预预机机制制尚尚不不清清楚楚，有有必必要要进进行行更更深深入入的的研研究究。微微嵌嵌合合广广义义上上是是指指机机体体内内含含有有少少量量其其他他个个体体的的细细胞胞或或 成成分分，包包括括输输血血、移移植植以以及及妊妊娠娠期期间间产产生生的的嵌嵌合合体体。最最近近的的研研究究表表明明，间间充充质质干干细细胞胞形形成成的的微微嵌嵌合合体体可可以以诱诱导导稳稳定定的的免免疫疫耐耐受受 。因因此此，微微嵌嵌合合可可能能是是 诱诱导导自自身身免免疫疫耐耐受受的的机机制制之之一一。，十十八八烷烷基基 ，四四甲甲基基三三碳碳氰氰基基碘碘化化物物（，）是是一一种种亲亲脂脂性性荧荧光光染染料料，常常作作为为示示踪踪荧荧光光标标记记细细胞胞 。本本研研究究用用 标标记记 ，输输入入 大大鼠鼠进进行行干干预预。用用小小动动物物活活体体成成像像系系统统观观察察 在在大大鼠鼠体体内内的的迁迁徙徙和和分分布布，分分析析微微嵌嵌合合形形成成的的部部位位和和强强度度，为为 治治疗疗 提提供供实实验验依依据据。材材料料和和方方法法 材材料料无无特特定定病病原原体体（，）级级 雌雌性性大大鼠鼠 只只，周周龄龄，体体质质量量 ，用用于于构构建建 模模型型。级级 雄雄性性大大鼠鼠 只只，周周龄龄，体体质质量量 ，用用于于提提取取骨骨髓髓源源单单个个核核细细胞胞，均均购购自自贵贵州州医医科科大大学学实实验验动动物物中中心心。青青霉霉素素 链链霉霉素素溶溶液液、培培养养基基购购自自 公公司司；胎胎牛牛血血清清购购自自 公公 司司；粒粒 细细 胞胞 巨巨 噬噬 细细 胞胞 集集 落落 刺刺 激激 因因 子子（，）和和白白细细胞胞介介素素 （，）购购自自 公公司司；购购自自 公公司司；完完全全佐佐剂剂（，）和和 脂脂 多多 糖糖（，）购购自自 公公司司；红红细细胞胞裂裂解解液液购购自自天天根根生生化化科科技技有有限限公公司司；荧荧光光染染料料购购自自北北京京泛泛博博生生物物公公司司；（）标标记记的的抗抗 （）抗抗体体（）、异异硫硫氰氰酸酸荧荧光光素素（，）标标记记的的抗抗 抗抗体体（）、藻藻红红蛋蛋白白（，）标标记记的的抗抗 抗抗体体（）购购自自 公公司司；由由两两条条互互补补的的经经硫硫代代磷磷酸酸酯酯修修饰饰的的寡寡核核苷苷酸酸单单链链结结合合而而成成，参参考考 等等 使使用用的的 核核 苷苷 酸酸 序序 列列，其其 中中 正正 义义 序序 列列 为为 ，下下划划线线处处碱碱基基序序列列能能竞竞争争性性结结合合 活活化化相相关关的的酶酶，从从而而抑抑制制 成成熟熟 ，委委托托上上海海生生物物工工程程公公司司合合成成；小小动动物物活活体体成成像像仪仪购购自自 公公司司，型型号号：。方方法法 骨骨髓髓源源单单核核细细胞胞分分离离 雄雄性性 大大鼠鼠通通过过腹腹膜膜注注射射 水水合合氯氯醛醛麻麻醉醉，无无菌菌取取下下双双侧侧胫胫骨骨。剪剪去去胫胫骨骨两两端端使使骨骨髓髓腔腔暴暴露露。注注射射器器吸吸取取 反反复复冲冲洗洗骨骨髓髓直直至至胫胫骨骨变变白白。骨骨髓髓在在 目目筛筛网网中中研研磨磨过过滤滤后后，收收 集集 在在 离离 心心 管管 中中，离离心心 。弃弃上上清清后后，加加入入红红细细胞胞裂裂解解液液去去除除红红细细胞胞。用用含含 胎胎牛牛血血清清的的 洗洗涤涤 次次后后，收收获获细细胞胞沉沉淀淀。细细胞胞重重悬悬于于 培培养养基基中中，调调整整细细胞胞数数为为 个个 。将将 细细胞胞悬悬液液接接种种在在 孔孔板板中中，在在 、培培养养箱箱中中培培养养 。最最后后弃弃去去非非贴贴壁壁细细胞胞，用用预预热热 清清洗洗 次次，获获得得的的贴贴壁壁细细胞胞大大部部分分为为单单核核细细胞胞。的的诱诱导导 收收获获的的单单核核细细胞胞在在完完全全培培养养基基中中继继续续培培养养。培培养养开开始始时时，加加入入 和和 以以诱诱导导单单核核细细胞胞源源 。同同时时加加入入 以以增增加加 的的耐耐受受性性。细细胞胞实实验验分分 组组，重重复复 次次。对对照照 组组：仅仅添添加加细细胞胞因因子子；诱诱骗骗剂剂 组组：细细胞胞因因子子联联合合 。在在第第 天天加加入入，每每 进进行行一一次次半半量量换换液液，同同时时补补充充细细胞胞因因子子，培培养养第第 天天收收获获细细胞胞。流流式式细细胞胞术术检检测测诱诱导导 的的 、和和 表表达达 流流式式细细胞胞术术检检测测 、和和 来来评评估估 的的纯纯度度和和成成熟熟度度。简简而而言言之之，收收获获培培养养至至第第 天天的的细细胞胞，洗洗涤涤后后收收集集 个个细细胞胞 管管于于流流式式管管中中。用用 重重悬悬细细胞胞后后，依依次次加加入入 、。另另设设阴阴性性对对照照管管，不不加加任任何何抗抗体体。避避光光孵孵育育 后后，用用 洗洗涤涤 次次，最最后后 重重悬悬，所所得得单单细细胞胞悬悬液液用用流流式式细细胞胞仪仪检检测测，数数据据用用细胞与分子免疫学杂志（），（）分分析析。大大鼠鼠 模模型型的的建建立立 雌雌性性 大大鼠鼠用用于于构构建建 模模型型。将将 干干粉粉用用 乙乙酸酸溶溶解解为为剂剂量量 的的溶溶液液，保保持持过过夜夜。与与等等体体积积的的 溶溶液液充充分分混混合合，制制备备 乳乳剂剂。在在大大鼠鼠左左足足底底部部皮皮下下，用用 乳乳剂剂免免疫疫，对对照照大大鼠鼠在在相相同同部部位位注注射射等等量量的的生生理理盐盐水水。抗抗原原负负载载及及 标标记记 培培养养至至第第 天天的的 加加入入 溶溶液液。第第 天天收收获获抗抗原原特特异异性性 ，离离心心 后后，用用预预冷冷的的 洗洗涤涤 次次。将将 荧荧光光染染料料加加入入到到细细胞胞悬悬液液中中，分分装装到到培培养养皿皿中中，放放入入培培养养箱箱孵孵育育 。收收集集细细胞胞，离离心心 后后弃弃上上清清，用用 洗洗涤涤 次次。用用预预冷冷的的 调调整整细细胞胞数数为为 个个 。最最终终获获得得 标标记记的的抗抗原原特特异异性性 ，记记为为 。细细胞胞输输注注 大大鼠鼠随随机机分分为为 组组，每每组组 只只。组组：在在构构建建 模模型型的的第第 天天，经经大大鼠鼠尾尾静静脉脉输输注注 个个 ；模模型型组组：相相同同时时间间点点注注射射等等量量生生理理盐盐水水。小小动动物物活活体体成成像像 在在细细胞胞注注射射后后的的 、，麻麻醉醉大大鼠鼠后后，用用 小小动动物物活活体体成成像像仪仪检检测测荧荧光光信信号号。设设置置激激发发波波长长为为 ，发发射射波波长长为为 。图图像像用用 处处理理分分析析，在在相相同同的的设设置置条条件件下下，对对选选取取的的区区域域进进行行荧荧光光强强度度分分析析，荧荧光光强强度度用用单单位位时时间间单单位位面面积积最最大大光光子子数数（）表表示示。离离体体器器官官成成像像 细细胞胞输输注注的的第第 天天，处处死死大大鼠鼠并并取取下下主主要要器器官官心心、肝肝、脾脾、肺肺、肾肾、肠肠系系膜膜淋淋巴巴结结。用用预预冷冷 冲冲洗洗后后，置置于于成成像像仪仪下下分分析析荧荧光光信信号号。统统计计学学分分析析 所所有有实实验验数数据据采采用用 进进行行统统计计分分析析，计计量量资资料料用用 表表示示，独独立立样样本本 检检验验用用于于两两组组间间均均数数比比较较，为为差差异异有有统统计计学学意意义义。结结果果 表表现现出出不不成成熟熟的的形形态态特特征征，高高表表达达 、低低表表达达 、培培养养至至第第 天天的的各各组组细细胞胞大大部部分分呈呈疏疏松松贴贴壁壁生生长长，各各组组均均可可见见特特征征性性细细胞胞集集落落形形成成，而而 组组集集