浅析代谢组学临床血清及血浆样本的采集与前处理方法_邱伟华.pdf

江西医药2022年11月 第57卷 第11期Jiangxi Medical Journal，November 2022，Vol 57，No11摘要：代谢物的识别和定量在临床代谢组学中被用于衡量与疾病、药物等干扰相关的变化，由于临床代谢组学研究所具有的“整体性”特点与中医药理论不谋而同，故其在中药新药研发临床阶段的应用已经愈发广泛。而在临床代谢组学中，血液样本是最常用的研究材料之一，其复杂性和多样性是分析的一大难点，一些血液样本采集或处理过程中的不规范操作会极大的影响血液样本的质量，从而使得代谢组学的研究结果产生偏倚，故本文对影响代谢组学血液样本分析的变量进行了系统讨论。此外，笔者还提出了关于血液样本选择、采集、前处理、存储条件及质控样本的建议，以供相关研究和标准操作程序制定参考。关键词：临床血液样本；采集；预处理；质控样本；规范化中图分类号：R446.1文献标识码：B文章编号：1006-2238(2022)11-2002-06DOI：10.3969/j.issn.1006-2238.2022.11.093基金项目：江西省自然科学基金青年基金，编号 20224BAB216099；国家自然科学基金青年基金，编号 82204590通信作者：吕尚浅析代谢组学临床血清及血浆样本的采集与前处理方法邱伟华1，熊琴平1，何志梅1，夏立1，吕尚2（1.江西省疾病预防控制中心，南昌 330029；2.江西中医药大学，南昌 330000）代谢组学（Metabolomics）研究的主要内容是生物体系新陈代谢动态进程中代谢产物的变化规律以及应激后（用药、患病等）代谢产物随时间变化的情况，以期最终阐明生物体系的代谢途径并揭示机体生命活动代谢本质1。代谢组学目前已经成为了包括临床诊断2、早期疾病监测3、临床不良反应监测4、疾病生物标志物鉴定5、药物作用机制研究6等领域的首选研究手段之一，病理变化可以通过组织和生物体液样本中代谢物的异常变化来表现，临床代谢组学的一般研究过程见图1。而在临床代谢组学中，血液样本是最常用的研究材料之一，其中主要包括血清和血浆7，而血液样本（尤其是大批量血液样本）的复杂性和多样性便成为了代谢组学，尤其是非靶向代谢组学的一项重大挑战。因此，血液样本的质量对于有效的诊断和适当的治疗决定，以及可靠的、结论性的研究结果来说是至关重要的。大批量血液样本的质量往往取决于高重复性的收集和处理标准操作程序（Standard Operating Procedures，SOP），一些血液样本采集或处理过程中的不规范操作（如采血方式不准确、样本运输延迟、储存温度不适当）会极大的影响血液样本的质量8-11。根据文献报道，不规范、不准确的血液样本前处理将会造成60%80%的临床代谢组学测试误差12-15，但通常来说，人们往往会忽视血液样本前处理方法，而把测试方法或仪器参数当做误差的主要来源。更加重要的是，在进行代谢组学研究时，所使用的血液样本类型、采集方法和前处理方法应保持一致，以此才能够保证代谢组学分析的平行性和结果的科学性。近年来基于代谢组学的血液样本分析技术水平和应用范围有较大提高和拓展16，应用包括研究人类疾病以定义病理生理过程和发现生物标志物、研究药物毒性和疗效、研究环境与基因型的相互作用(如营养基因组学，nutrigenomics)和脂质研究(脂质组学，lipidomics)17。但许多研究人员对样本分析前的变量控制重视程度仍然不够，这可能导致偶然误差的增加，降低结果的可靠性和科学性，并且混淆最终的研究结果（如代谢轮廓模糊等）。图 1 临床代谢组学一般研究过程 公共卫生 2002江西医药2022年11月 第57卷 第11期Jiangxi Medical Journal，November 2022，Vol 57，No11因此，应该制定详细实验设计和规范血液样本前处理SOP，并且严格执行，以此确保能够获得可信的结果。本文对影响代谢组学研究的血液样本分析前的变量进行了系统讨论。此外，本研究还提出了关于血液样本选择、采集程序、前处理程序和存储条件的建议，以供相关研究和SOP制定参考。1血液样本的选择血清和血浆样本均被广泛应用于靶向和非靶向代谢组学研究，两者相似但不完全相同。血清是自然凝血过程后残留的物质，其中的血细胞以及参与凝血的蛋白质已被清除；血浆是在用抗凝剂处理血液样本以防止凝块形成，通过离心除去细胞而得。这两种从血液中去除细胞的方法将导致代谢组略有不同。就代谢轮廓来说，两者的代谢物种类（峰数量）差异不大，而一些代谢物在两者中的浓度（峰面积）差异较大。选择血清或血浆开展代谢组学研究，取决于研究的目标代谢物类型以及检测方法，如：液相-质谱联用（Liquid Chromatog-raphy-Mass Spectrometry，LC-MS）、气相-质谱联用（gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）或核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）。实际上，无论检测方法是LC-MS还是GC-MS，血清和血浆样本在由主成分分析（PrincipalComponent Analysis，PCA）所得的得分图上都有明显不同18-19。Liu20等人以超高效液相-质谱联用（Ultra Performance Liquid Chromatography-MassSpectrometry，UPLC-MS)为检测手段，对不同的血清和血浆样本进行了代谢轮廓对比分析，在216个已鉴定的代谢物中，46%的代谢物水平存在显著差异（P0.05），只有3个代谢物（蛋氨酸、乙酰肉碱、丙酰肉碱）在血清中水平较低。显然，血浆和血清的选择必须基于实际考虑，然而，考虑到血浆和血清中可能存在的样本组成差异，应注意确保在任何特定研究中只使用一种样本类型。笔者总结了近3年以来血浆与血清在临床代谢组学中的应用实例（见表1）。序号样本类型分析仪器受试人数研究内容文献来源1血浆plasmaGC-MS132确定诊断肝细胞球囊化的新血液标志物Yuji Ogawa212NMR54血液和尿液代谢谱反映了过敏反应中不同的代谢途径Chiu C Y223LC-MS177鞘髓磷脂(321)与缺血性卒中发生率之间具有负相关Lind L234LC-MS79支链氨基酸与溶血磷脂酰胆碱在泰国人群中于糖尿病的发生率之间分别具有正相关与负相关Chailurkit L O245LC-MS67筛选得到的11种潜在生物标志物能够预测宫颈癌病变的不同阶段Qiu F256LC-MS85可以根据血浆中代谢物浓度来区分小儿慢性肾病患者和对照人群Benito S267GC-MS97筛选得到6种潜在生物标志物与疼痛和疲劳呈负相关，3种生物标志物与之成正相关Lesnak J278LC-MS34脂肪酸类代谢物的改变表明帕金森功能和脂质代谢之间存在一定关系Okuzumi A289NMR-MS102与男性相比，与女性血铁蛋白和血红蛋白相关的代谢物包括脂肪酸类、支链氨基酸分解代谢物和血红素分解代谢物Kaul A2910LC-MS38约30%的血浆代谢组(235个代谢物)与血脂显著相关，27种血浆代谢物与甘油三酯呈显著相关Li K J3011LC-MS53急性缺血性脑卒中患者血浆脂质组成（准确定性得到368个脂质分子）与健康志愿者存在显著差异齐飚3112LC-MS195急性创伤性凝血病患者血清中L-苏氨酸等7种代谢物水平显著下降邓应彬3213LC-MS157抗结核药物引起的肝毒性与甘油磷脂代谢等3个代谢通路有关糜怡琨3314LC-MS402初步证实了结直肠癌患者体内存在着色氨酸代谢紊乱的异常情况杨阳3415LC-MS64ALT、总胆红素、SM(331)在湿热蕴结型、肝郁脾虚型慢性乙型肝炎存在明显差异黎晓3516血清serumLC-MS/GC-MS122熊去氧胆酸可通过调节氨基酸、黄酮和脂肪酸代谢途径发挥保肝作用Kim D J3617LC-MS13饮用马奶酒可调节肠道微生物群，降低免疫球蛋白G和白蛋白Hou Q3718LC-MS60全谷饮食不改变胰岛素敏感性和肠道微生物群，但减轻体重和全身低度炎症Roager H3819NMR20随着维生素强化无糖饮料的摄入，维生素B相关的代谢通量受到了干扰，包括同型半胱氨酸的短暂下调，已经5种代谢物的上调Mayengbam S3920GC-MS82高血压非裔美国人和白种美国人肠道菌群和血清代谢物存在一定差异Walejko J M4021LC-MS56筛选出7种与急性肺血栓栓塞症诊断密切相关的潜在生物标志物王静4122LC-MS26筛选了7种与巧囊患者腹腔镜手术联合醋酸亮丙瑞林与单纯腹腔镜手术患者相关的差异代谢物徐慧4223LC-MS130筛选出由半胱氨酸、丝氨酸、单酰基甘油酯联合而成的组合标志物作为非吸烟女性肺腺癌的诊断性肿瘤标志物穆颖4324NMR90丙酮和3-羟基丁酸对慢性心力衰竭的诊断可提供较高的临床诊断价值张鹏4425LC-MS164胱氨酸等6种代谢物为有效的他克莫司肾毒性生物标志物夏天一451 血浆与血清在临床代谢组学中近三年的应用实例2003江西医药2022年11月 第57卷 第11期Jiangxi Medical Journal，November 2022，Vol 57，No112血液样本的采集大批量、大规模代谢组学研究中最重要的一个部分就是正确的收集样本集。临床上采集血浆常用的抗凝剂有乙二胺四乙酸（EDTA）、枸橼酸（柠檬酸）盐以及肝素盐等。其抗凝血机制分别为：（1）EDTA是通过与血液中的Ca2+形成配位化合物，从而抑制凝血活性；（2）枸橼酸（柠檬酸）盐是通过与血液中的Ca2+形成可溶性的螯合物，从而使Ca2+失去凝血作用；（3）肝素与血液中的抗凝血酶III结合后能增强其抗凝血活性，并且同时能降低丝氨酸蛋白酶的凝血活性，从而阻止血小板的聚集。相应的，以上三种抗凝剂的一般选择原则为：（1）枸橼酸盐是机体内三羧酸循环（TricarboxylicAcid Cycle，TAC）的中间产物，以其作为血浆抗凝剂会对代谢组学的测定结果造成干扰，如果研究内容包括与TAC相关的代谢通路和靶点，一般不建议选择枸橼酸盐作为抗凝剂46；（2）EDTA（盐）应用于NMR代谢谱时会产生很强的噪音信号47，而应用于LC-MS或GC-MS代谢组学分析时无此现象，因此在以MS作为代谢组学检测平台时，笔者建议以EDTA（盐）作为血浆抗凝剂；（3）肝素是2种多糖交替连接形成的大分子多聚体，因此肝素盐会在LC-MS代谢谱中产生严重的干扰信号48-49，但由肝素盐作为抗凝剂采集的血浆将含有更多的代谢物。就目前来说，血浆代谢物研究应采用何种抗凝剂依然没有明确的规范和建议。因此在收集血浆样本之前，研究者应该综合研究对象和检测技术类型对抗凝剂特点和局限性进行全面考虑，使其能够适用于整个研究过程，避免不必要的干扰。血清样本在临床上的收集一般采用无添加剂（常规）和添加血清分离胶（快速）两种方法。无添加剂采血时，全血经过较长时间（3060 min）自然凝固后析出血清；而添加血清分离胶（separate gel，高分子半固体疏水性胶体）与全血一同离心时，将形成三层：血清（上层）、血清分离胶（中层）及血细胞（下层）。如此，首先能够有效的避免溶血以及凝血时间不一致对检测结果带来的干扰，其次能够大大缩短样本收集时间，提高效率和样本品质。笔者将临床所用的采血管（含凝血剂或促凝剂）总结归纳于表2。3血液样本的前处理表 2 临床采血管分类及适用范围采血管颜色采集样本类型添加剂适用范围操作要求红色血清无生化和免疫学检测、血清代谢组学采血后静置凝血，不需振摇黄色血清促凝剂和分离胶急诊生化和免疫学检测、血清代谢组学采血后静置凝血，不需振摇绿色血浆肝素锂生化实验、血浆代谢组学采血后立即振摇58次血浆肝素钠流式T细胞因子检测、血浆代谢组学灰色血浆血糖降解抑制剂血糖检测等采血后立即振摇58次黑色全血109mmol/L枸橼酸钠血沉检测等抗凝剂:全血=14，采血后立即振摇58次蓝色全血109mmol/L枸橼