皮肤鳞状细胞癌患者外周血P...-1表达与肿瘤免疫逃逸相关_杨雪琪.pdf

哈尔滨医药 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期哈尔滨医药 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期皮肤鳞状细胞癌（cSCC）是仅次于基底细胞癌的皮肤第 2 大恶性肿瘤，常见的疾病演变过程多由光化性角化病（AK）发展而来，进而演变为原位鳞状细胞癌、浸润性 cSCC、最终发展为转移性 cSCC1。鳞癌的发病主要与长期紫外线累积辐射有关，其他危险因素包括病毒感染、遗传、免疫因素等。近年来新的靶向治疗药物如表皮生长因子受体抑制剂西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼，LD-1 抑制剂西米普利单抗已经逐步应用于临床治疗晚期转移性cSCC 中，并取得了一定的效果2-3。尽管大多数的皮肤鳞状细胞癌都具有良好的预后，但一部分 cSCC具有高度的转移侵袭能力，其发病率仍在以每年2%4%的速度增加4。因此，目前需要新的具有抗肿瘤转移侵袭的生物学靶点来延缓 cSCC 的晚期转移，延缓疾病的生存期。诱导型程序性死亡配体 1（PD-L1、PD-L1、CD274），B7 家族的抑制性分子5。1999 年董海东等人发现了这一和 B7-1、B7-2 具有同源性，由免疫球蛋白 V 和 C 样结构域、疏水性跨膜蛋白域和 30个氨基酸组成的 I 型跨膜蛋白结构，并将其命名为皮肤鳞状细胞癌患者外周血 PD-L1 和 PD-1 表达与肿瘤免疫逃逸相关杨雪琪1栗丹2闵玮1（通讯作者）（1.苏州大学附属第一医院皮肤科，江苏 苏州 215006；2.南京鼓楼医院，江苏 南京 210009）摘要目的探究 PD-L1 在皮肤鳞状细胞癌（cSCC）中的表达，并探讨它们在肿瘤免疫逃逸中的可能作用。方法首先采用免疫组化方法检测年龄匹配的正常健康人、癌前病变患者和临床诊断为 cSCC 的皮肤组织样本中 PD-L1 分子的表达。免疫荧光法检测 PD-L1 在原代上皮细胞和皮肤鳞状细胞系 A431 中的表达。此外，我们还采用流式细胞术检测了 cSCC 患者外周血 CD14 阳性细胞中 PD-L1 的表达情况以及外周血 T 细胞中 PD-1 的表达情况，并分析了 PD-L1 在不同人群中的表达水平差异。结果免疫组化结果显示，PD-L1 在光化性角化组织和鳞状细胞癌组织中表达显著上调，在正常皮肤组织中表达显著下调。免疫荧光结果显示 PD-L1 在原代上皮细胞和皮肤鳞癌细胞间差异有统计学意义。此外，PD-L1 的增加与性别、年龄和肿瘤危险因素无相关性（P0.05）。我们的研究结果还证实了 cSCC 外周血 CD14 阳性细胞中 PD-L1 等共抑制分子以及 PD-L1配体 PD-1 在外周血 T 细胞中显著高表达。结论PD-L1 在 cSCC 的发生和肿瘤的免疫逃逸中发挥重要作用，这为 PD-L1 分子作为 cSCC 早期诊断和免疫治疗的潜在靶点提供了可能。关键词皮肤鳞状细胞癌；PD-L1；PD-1；免疫逃逸；免疫治疗中图分类号R751文献标识码A学科分类代码：32067文章编码：1001-8131（2023）01-0005-04DOI：10.3969/j.issn.1001-8131.2023.01.002Peripheral Blood Expression of PD-L1 and PD-1 Associated With TumorImmune Escape inCutaneous Squamous Cell Carcinoma PatientYang XueqiLi DanMin Wei（1.Department of Dermatology，The First Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou 215006，China；2.Department ofDermatology，The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School，Nanjing 210009，China）AbstractObjectiveTo clarify the expression of PD-L1 in Cutaneous Squamous Cell Carcinoma（cSCC），and discusstheir possible roles in tumor immune escape.MethodsFirst，we used immunohistochemistry method to examined the expression of PD-L1 molecule in age-matched normal subject samples，precancerous lesion samples and clinical skin cSCC tissuesamples.And immunofluorescence was applied to detect the expression of PD-L1 in primary epithelial cells and skin squamous cell line A431.In addition，we also detected the expression of PD-L1 in the peripheral blood CD14 positive cells andPD-1 in peripheral T cells of cSCC patients by flow cytometry method，then analyzed the differences in PD-L1 expressionlevels in different populations.ResultsImmunohistochemical results showed a significant upregulation of PD-L1 in actinickeratinized tissues and squamous cell carcinoma tissues and a significant down-regulation of PD-L1 in normal skin tissues.Results of immunofluorescence showed a strongly difference of PD-L1 between primary epithelial cells and skin squamouscell.Furthermore，the increase of PD-L1 was no strongly associated with gender，age，and tumor risk factors.In addition（P0.05），the results also proved a significant high expression of co-inhibitory molecules such as PD-L1 in peripheral blood CD14 positive cells and PD-L1 ligands PD-1 in peripheral T cells of cSCC.ConclusionOur results suggest that PD-L1 playsan important role in the occurrence of cSCC and the immune escape of tumors，and it provides the possibility for PD-L1molecules to be used as a potential target for early diagnosis and immunotherapy of cSCC.Key wordsCutaneous Squamous Cell Carcinoma；PD-L1；PD-1；Immune escape；Immunotherapy基金项目：江苏省卫生健康委医学科研项目（H2019050）5哈尔滨医药 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期哈尔滨医药 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期“PD-L1”6。在慢性感染和肿瘤中，PD-L1 与程序性细胞死亡 1（PD-1）结合，共同诱导 T 细胞“衰竭”7。据 Latchman 等人报道，PD-L1 与 PD-1 的作用是通过阻断细胞周期，而不是诱导细胞死亡而抑制 T 细胞增殖8。此外，PD-L1 被报道、包括肺癌9、乳腺癌10、胰腺癌11、肾癌12、大肠癌13、胃癌14、宫颈癌15等多种实体瘤和血液淋巴瘤16中异常高表达，并且发现PD-L1 的表达量与临床具有显著相关性。目前，针对 PD-1/PD-L1 和 CTLA-4/B7 的免疫检查点抑制剂己陆续被报道成功应用于癌症治疗17-18。然而，PD-L1 在皮肤非黑色素性皮肤癌，尤其是鳞状细胞癌中的表达情况及作用机制尚不清楚。在本研究中，我们发现了负性共刺激分子 PD-L1 在皮肤鳞癌组织、鳞癌细胞系 A431、外周血CD14 阳性细胞，以及外周血 T 细胞中其受体 PD-1均呈高表达。此外，我们还分析了 PD-L1 的表达水平与年龄、部位、肿瘤大小及病理分级等临床病理变量之间的关系。1资料与方法1.1一般资料1.1.1患者和临床组织标本：鳞癌组织和对照组组织标本来源于 2009 至 2015 年于苏州大学附属第一医院皮肤科和整形科接受手术治疗并经病理诊断的 136 例石蜡切片（96 例皮肤鳞癌，20 例日光性角化，20 例正常皮肤组织）进行免疫组化染色分析。所有患者术前均未接受化疗或放疗。皮肤鳞癌组织及日光性角化组织标本均经 HE 染色，病理确诊。其中皮肤鳞癌患者年龄 2085 岁（男性 47 例，女性 49 例）。本研究经我院伦理委员会批准，所有患者在入组前均提供书面知情同意书。1.1.2血液样本：血液标本来源于苏州大学第一附属医院病房的 15 例皮肤鳞癌患者，15 例日光性角化患者，10 例正常人。所有皮肤鳞状细胞癌患者均首次被诊断为皮肤鳞状细胞癌。1.2方法1.2.1细胞的来源与分离培养：cSCC 细胞系 A431购自中国科学院细胞研究所，培养于含 10%热灭活胎牛血清和 1%青霉素/链霉素的 RPMI 1640 培养基中，人原代上皮细胞（PKC）来源于健康的新生儿包皮。将包皮与皮下组织分离，获得高纯度包皮。将包皮切成小块，用 PBS、碘伏和青霉素/链霉素浸泡。离心收集过滤后的液体（2000g，10min）。沉淀用DMEM 培养基分散，转移到 3cm 培养皿中恒温培养半 30min。1h 后，将细胞悬液转移到另一个 3cm烧瓶中培养。1.2.2免疫组化：所有手术切除的标本用 10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋切片。使用 ChemMateTM Envision/HRP 技术在选定的载玻片上进行IHC。简单地说，切片脱蜡脱水，内源性过氧化物酶活性被 H2O2阻断。切片用 PD-L1 和 CXCR4 一级抗体和二级抗体孵育，并用二氨基苯肼（DAB）显示，PBS 冲洗以去除多余的抗体。最后，将苏木精滴入组织中重新染色，并组织密封。免疫组化学结果评估通过显微镜观察进行打分。打分依据是肿瘤组织染色程度的深浅以及阳性细胞的比例，然后根据二级计分法评分。1.2.3免疫荧光：固定的细胞在 0.2Triton X-100的 PBS 中浸润 5min，盖玻片和切片用 5山羊血清在 PBS 中封闭溶液孵育 10min。吸出封闭液，并将细胞和组织与一抗在 4C 下孵育过夜。盖玻片和切片用 PBS 洗涤 3 次，5min/次。将盖玻片和切片与二抗在潮湿，黑暗的环境中孵育 1h。用 PBS 清洗后，向盖玻片和切片中加入 10L 含 DAPI 的抗褪色封固剂，进行核染色。通过 Image J 2.0 计算免疫荧光强度。1.2.4流式细胞术：流式细胞术分离的皮肤鳞癌细胞系 A431