脾虚症并发白念珠菌感染小鼠...化及秋泻灵颗粒治疗对其影响_李家生.pdf

收稿日期：；修订日期：基金项目：国家自然科学基金地区基金（）作者简介：李家生（），男（彝族），云南玉溪人，云南中医药大学中药学院在读硕士研究生，主要从事抗真菌感染免疫相关工作通讯作者简介：王睿睿（），女（汉族），安徽明光人，云南中医药大学中药学院教授，博士学位，主要从事抗感染药理研究工作脾虚症并发白念珠菌感染小鼠血常规及血浆细胞因子的变化及秋泻灵颗粒治疗对其影响李家生，徐志昌，陈慧婷，秦定梅，张 祎，王睿睿（云南中医药大学中药学院，云南 昆明）摘要：目的 通过检测小鼠血常规、血液生化指标以及血浆中细胞因子含量的变化，探讨脾虚造模并发白念珠菌感染对小鼠免疫功能的影响以及秋泻灵颗粒对其的疗效。方法 只 级昆明小鼠随机分成 组，按照复合因素法制备脾虚模型，脾虚造模结束第 天，脾虚感染模型组和给药治疗各组小鼠经口灌胃白念珠菌悬液（，只），次日开始按分组给药，每日 次，连续 天。记录各组小鼠实验期间体质量变化，末次给药 后，处死小鼠，检测血液、肾脏和粪便菌落数，检测免疫器官脏器系数，全血检测血常规，血浆检测尿素氮、肌酐、谷丙转氨酶、谷草转氨酶及 、细胞因子含量。结果 脾虚小鼠经口灌胃白念珠菌感染 天后，体重，脾脏、胸腺系数，外周血中白细胞数目、淋巴细胞数目、单核细胞数目、中性粒细胞数目，均显著低于其他各组，血浆中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐的含量均显著高于正常对照组，秋泻灵颗粒给药治疗后可有效降低白念珠菌感染脾虚小鼠的粪便载菌量，显著提升脾脏、胸腺脏器系数，显著提升外周血中白细胞、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞的数目，上调血浆中 的水平，降低血浆中谷丙转氨酶、谷草转氨酶和肌酐的含量。结论 脾虚造模可降低小鼠免疫功能，秋泻灵颗粒给药能明显改善小鼠脾虚状态，能有效提高脾虚症并发白念珠菌感染小鼠的免疫功能。关键词：脾虚模型；白念珠菌；血常规；细胞因子；秋泻灵颗粒 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，）：，（，），：；时珍国医国药 年第 卷第 期 脾虚证属中医学中临床上较为常见的一种证型，以脾气虚为主，脾气虚的诱因复杂多样，多归结于饮食不节、嗜食肥甘厚腻、劳倦过度。中医理论体系认为，脾为后天之本，气血生化之源，主运化水谷精微，气机升降之枢纽。金匮要略曰：“四季脾旺不受邪”。灵枢本脏篇 也提到：“脾坚，则脏安难伤”。虽然中医学认为脾主运化，与免疫学认为的淋巴器官脾脏不同，但如前所述诸多医学古籍也指出脾气健旺则外邪不易入侵，说明中医学也认为脾脏功能的强弱与机体的免疫防御功能有着十分密切的关系。西医理论中的脾是人体最大的淋巴器官，属于循环系统，有造血、储血、滤血、清除衰老红细胞以及参与机体免疫反应等的功能，现代研究也证明了中医学的脾虚证会导致机体防御功能下降，造成全身免疫功能失调。白念珠菌作为一种肠道共生性和机会致病性真菌，易感染免疫低下或缺陷患者，在免疫缺陷的个体可进展为严重的侵袭性感染。中医理论认为白念珠菌感染的病机多为脾虚湿热，实验研究也发现当机体处于脾虚状态时，白念珠菌的易感性增加。本实验旨在从血常规和免疫功能的角度解读中医脾虚湿热易感白念珠菌的原因，并通过药物治疗前后相关指标的对比分析，以期为临床诊断和疗效评价提供参考。材料与仪器 实实验验动动物物 只 级昆明小鼠，周龄，体质量 ，雌雄各半，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号（湘）。动物饲养于云南中医药大学动物实验中心清洁级动物房，适应性喂养常规饲料及饮用水，饲养温度 ，相对湿度为，光照周期，云南中医药大学动物室许可证号：（滇）。本动物实验由云南中医药大学动物伦理委员会批准，伦理学批号。主主要要药药物物 秋泻灵颗粒：云南永安制药有限公司，购置于云南鸿翔一心堂药业（集团）股份有限公司，规格：袋 袋 盒，产品批号：；氟康唑分散片：南昌弘益药业有限公司，购置于云南鸿翔一心堂药业（集团）股份有限公司，规格：片 片 盒，产品批号：。主主要要试试剂剂 沙氏琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司，货号：），羧甲基纤维素钠（天津百伦斯生物技术有限公司，批号：），谷丙转氨酶（，货号：）、谷草转氨酶（，货号：）、尿素氮（，货号：）、肌酐试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号：），细胞因子检测试剂盒（，货号：）。主主要要仪仪器器 生物安全柜（新加坡 公司）；高速低温组织研磨仪（武汉塞维尔生物科技有限公司）；恒温恒湿培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；高速冷冻离心机（公司）；电子分析天平（赛多利斯（上海）贸易有限公司）；迈瑞兽用全自动血液细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；全自动酶标仪（帝肯（上海）贸易有限公司）。方法 实实验验分分组组、模模型型制制备备及及给给药药 小鼠适应性喂养 周后随机分为 个组，即正常对照组（）、脾虚对照组（）、脾虚 白念珠菌感染模型组（）、脾虚 白念珠菌感染 氟康唑治疗组（）、脾虚 白念珠菌感染 秋泻灵治疗组（）、脾虚 白念珠菌感染 秋泻灵 氟康唑联合治疗组（），每组雌雄各 只。除 组以外，其余各组按照复合因素法制备脾虚模型。单日小鼠游泳直到力竭，身体蜷缩，喂食生甘蓝，正常饮水。双日灌胃猪油 只，依次交替造模 天。脾虚造模结束第 天即实验第 天，、各组小鼠经口灌胃白念珠菌悬液（，只），、组灌胃等量生理盐水（只）。白念珠菌灌胃次日开始给药，每日次 次，连续 天。、组按体质量灌胃纯水（），组按体质量灌胃氟康唑药液（，），组按体质量灌胃秋泻灵药液（，），组按体质量灌胃氟康唑与秋泻灵混合药液（，）。取取材材 末次给药 后用 戊巴比妥麻醉小鼠，腹主动脉取小鼠全血，吸取 用全自动血液细胞分析仪检测血常规，其余血液静置 后，离心，吸取血浆 冻存待检；摘取脾脏、胸腺并称重；摘取适量肾脏组织并称重；收集适量粪便并称重。检检测测指指标标 小小鼠鼠生生存存状状态态及及体体质质量量变变化化观观测测 观察各组小鼠实验期间生存状态的变化，称取记录各组小鼠体质量。血血液液、肾肾脏脏、粪粪便便菌菌落落数数检检测测 吸取全血 涂布于已经制备好的沙氏培养基中，放入 恒温培养箱中培养 之后进行菌落计数；根据称取的肾脏、粪便重量，按照：的比例，加入无菌生理盐水，用研磨仪研磨，制成 浓度的粪便匀浆液。再按照倍比稀释的方法加入无菌生理盐水，将：倍的肾脏、粪便匀浆液稀释至 浓度，用移液枪吸取稀释完的液体 接种至已经制备好的沙氏培养基中，然后放入，恒温培养箱中培养 之后进行菌落计数。免免疫疫器器官官脏脏器器系系数数检检测测 在末次给药 后，处死小鼠，取主要免疫器官胸腺及脾脏称重，按照脏器系数 器官重量（）体重（）计算脏器系数。肝肝、肾肾功功能能检检测测 腹主动脉取小鼠全血，静置 后，离心，吸取血浆，依照试剂盒说明书采用微量法检测血浆中尿素氮（）、谷丙转氨酶（）、谷草转氨酶（）的含量，采用肌氨酸氧化酶法检测血浆中肌酐（）的含量。血血常常规规检检测测 腹主动脉取小鼠全血，吸取 用 迈瑞兽用全自动血液细胞分析仪检测血常规。血血浆浆细细胞胞因因子子检检测测 血浆采用 检测技术，送上海优宁维生物科技股份有限公司，用 （）试剂盒检测 、细胞因子含量。统统计计学学方方法法 采用 统计软件进行统计分析，数据以均数 标准差（?）表示，符合正态分布者组间比较采用单因素方差分析，不符合正态分布者组间采用非参数检验，为差异有统计学意义。结果 小小鼠鼠生生存存状状态态及及体体质质量量 脾虚造模期间除正常对照组以外，其余各组小鼠体重随造模时间单日下降双日上升，与正常对照组相比总体呈下降趋势，从造模第 天开始各组小鼠出现食少纳呆、便溏、反应迟钝、毛色晦暗的现象，造模 天后，造模小鼠出现便溏、肛门污秽，毛色枯槁，蜷缩聚堆，反应迟钝，甚至胆怯的状态；造模结束后各组体重均显著低于正常对照组（），说明脾虚造模成功。给药治疗后，给药各组小鼠粪便逐渐由稀变稠，由软变干，毛色有所改善逐渐有光泽，活动明显增加，精神状态有所好转；给药结束后，除模型组以外，其余各组小鼠体重与正常对照组相比均无明显差异；与模型组相比，各组小鼠体重均有显著性差异（，），详见表。菌菌落落数数检检测测结结果果 各组小鼠血液及肾脏匀浆中均未检测出白念珠菌。与正常对照组相比，除脾虚对照组外，其余各组小鼠粪便中念珠菌数量均显著增加（）；与模型组相比，其余 时珍国医国药 年第 卷第 期各组小鼠粪便中念珠菌数量均显著减少（），详见表。表 小鼠体质量比较结果（?）组别脾虚造模 天后小鼠体质量给药 天后小鼠体质量正常对照组 脾虚对照组 脾虚感染模型组 氟康唑治疗组 秋泻灵治疗组 氟康唑联合秋泻灵治疗组 与正常对照组比较，；与模型组比较，；表 菌落数检测结果（?）组别血液菌落数 肾脏菌落数 粪便菌落数 正常对照组 脾虚对照组 脾虚感染模型组 氟康唑治疗组 秋泻灵治疗组 氟康唑联合秋泻灵治疗组 与正常对照组比较，；与模型组比较，；免免疫疫器器官官脏脏器器系系数数检检测测结结果果 与正常对照组相比，脾虚对照组和模型组小鼠胸腺及脾脏脏器系数均显著下降（）；与模型组相比，给药各组小鼠胸腺及脾脏脏器系数均有所提升，其中以秋泻灵治疗组最为显著（），详见表。表 脾脏、胸腺脏器系数检测结果（?）组别脾脏系数胸腺系数正常对照组 脾虚对照组 脾虚感染模型组 氟康唑治疗组 秋泻灵治疗组 氟康唑联合秋泻灵治疗组 与正常对照组比较，；与模型组比较，；肝肝、肾肾功功能能检检测测结结果果 谷丙转氨酶检测结果显示，与正常对照组相比，除脾虚对照组和秋泻灵治疗组外，其余各组均显著升高（，），与模型组相比，仅秋泻灵治疗组能显著降低造模后谷丙转氨酶的含量（）；谷草转氨酶检测结果显示，与正常对照组相比，模型组显著升高，秋泻灵治疗组显著降低（），与模型组相比，秋泻灵治疗组和氟康唑联合秋泻灵治疗组能显著降低造模后谷丙转氨酶的含量，其中以秋泻灵治疗组最为显著（）；肌酐检测结果显示，与正常对照组相比，除脾虚对照组和秋泻灵治疗组外，其余各组均显著升高（，），与模型组相比，秋泻灵治疗组和氟康唑联合秋泻灵治疗组均能显著降低造模后肌酐的含量（）；尿素氮检测结果显示，与正常对照组相比，脾虚对照组、模型组和氟康唑治疗组显著降低（），与模型组相比，除氟康唑治疗组外，其余各组均显著上升（，），详见表。表 血液生化指标检测结果（?）组别谷丙转氨酶 谷草转氨酶 肌酐 尿素氮 正常对照组 脾虚对照组 脾虚感染模型组 氟康唑治疗组 秋泻灵治疗组 氟康唑联合秋泻灵治疗组 与正常对照组比较：，；与模型组比较：，；血血常常规规检检测测结结果果 血常规检测结果显示，与正常对照组相比，模型组小鼠白细胞数目和淋巴细胞数目显著降低（，），给药治疗后可显著提升小鼠白细胞数目和淋巴细胞数目（，），其中以秋泻灵治疗组较为显著；秋泻灵治疗组还可显著提升单核细胞数目和中性粒细胞数目（，）；与正常对照组相比，脾虚对照组和氟康唑治疗组小鼠血红蛋白含量显著提升；与正常对照组相比，脾虚对照组小鼠红细胞数目显著提升（，）；各组小鼠外周血淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、中性粒细胞百分比、血小板数目无显著性差异，详见表。表 小鼠外周血血常规检测结果（?）组别白细胞数目淋巴细胞数目单核细胞数目中性粒细胞数目正常对照组 脾虚对照组 脾虚感染模型组 氟康唑治疗组 秋泻灵治疗组 氟康唑联合秋泻灵治疗组 组别淋巴细胞百分比 单核细胞百分比 中性粒细胞百分比 正常对照组 脾虚对照组 脾虚感染模型组 氟康唑治疗组 秋泻灵治疗组 氟康唑联合秋泻灵治疗组 组别血红蛋白 红细胞数目血小板数目正常对照组 脾虚对照组 脾虚感染模型组 氟康唑治疗组 秋泻灵治疗组 氟康唑联合秋泻灵治疗组 与正常对照组比较：，；与模型组比较：，；血血浆浆细细胞胞因因子子检检测测结结果果 细胞因子检测结果显示，与正常对照组相比，模型组小鼠血浆中 水平明显降低，秋泻灵给药治疗后可显著提升血浆中 的水平（）；各组小鼠血浆中 、的水平无显著性差异，详见表。时珍国医国药 年第 卷第 期 表 细胞因子检测结果（?）组别 正常对照组 脾虚对照组 脾虚感染模型组 氟康唑治疗组 秋泻灵治疗组 氟康唑联合秋泻灵治疗组 与正常对照组比较：，；与模