奶牛PSME3基因CDS区克隆、表达及生物信息学分析_任倩倩.pdf

书书书西 北 农 业 学 报 ，（）：奶牛 基因 区克隆、表达及生物信息学分析收稿日期：修回日期：基金项目：宁夏高等学校科学研究项目（）；国家自然科学基金（，）；宁夏回族自治区重点研发计划（引才专项）（）；宁夏大学引进人才科研启动项目（）。第一作者：任倩倩，女，硕士研究生，研究方向为动物分子遗传育种。：通信作者：王兴平，男，教授，研究方向为动物基因表达调控与分子育种。：任倩倩，李宇航，杨箭，罗仍卓么，王兴平，魏大为，马云，（宁夏大学 农学院，银川 ；宁夏回族自治区反刍动物分子细胞育种重点实验室，银川 ）摘要旨在探讨蛋白酶体激活亚基（，）基因的序列特征，及其在奶牛乳腺组织中的表达和功能。采用 法检测 基因在健康奶牛和大肠杆菌（）诱导的乳腺炎奶牛的乳腺组织中的表达量；通过基因克隆与测序方法获得奶牛 基因的编码区（）全长序列，并利用生物信息学方法分析 基因及其编码的蛋白质的结构与功能。结果表明，与健康奶牛相比，基因在 诱导的乳腺炎奶牛乳腺组织中的表达显著上调；基因的 区全长为 ，编码条由 个氨基酸组成的较稳定且无跨膜结构域的非分泌型蛋白质，含有 和 结构域，主要在细胞核中发挥作用。可通过核转位因子（，）信号通路参与调节乳腺细胞的质膜合成、细胞周期、增殖凋亡以及奶牛乳腺组织的免疫反应等多种生物学过程。关键词奶牛；基因；生物信息学；基因表达；乳腺炎奶牛（）乳腺炎是奶牛养殖中最常见的炎症性疾病，通常由乳腺组织受到创伤或感染金黄色葡萄球菌（）和大肠杆菌（）等病原微生物引起，影响奶牛的健康、产奶量与乳品质，给奶牛场造成极大的经济损失，甚至威胁到人的饮食健康。近年来，关于奶牛乳腺炎预防与治疗在分子水平上的研究，取得了有效进展。蛋白酶体广泛存在于真核细胞的细胞质和细胞核中，可调节细胞生长周期和凋亡、调控基因转录以及 损伤修复等，具有十分重要的生物学功能。蛋白酶体激活亚基（，）又 称 抗 原、和 ，是蛋白激活 家族的成员，可结合并激活 蛋白酶体。通过泛素化和 非依赖性方式促进多种蛋白的降解，参与 、和 等信号通路，通过调节 、和 等因子而调控能量代谢、先天免疫、血 管 生 成 和 细 菌 感 染 等 多 种 生 理 学 过程，在口腔癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌 和甲状腺癌 等癌症组织中均高表达。此外，可负调控 ，参与调节细胞周期，抑制肿瘤发生并促进细胞凋亡。近年来研究表明，作为 信号通路的关键因子，在 人 类 炎 症 中 也 发 挥 重 要 的 调 控 作用，然而，在奶牛乳腺炎中的作用研究还未见报道。因此，本试验检测 基因在 型乳腺炎奶牛乳腺组织中的表达情况，并进行 基因 区的克隆、测序及功能预测分析，以期为进一步阐明 在奶牛乳腺炎中的作用提供参考。材料与方法 试验材料用于基因克隆的奶牛乳腺组织样采集于宁夏本地屠宰场。选取 月龄，处于泌乳盛期的荷斯坦奶牛，屠宰后收集乳腺组织，剪成小块分装到冻存管中，放入液氮带回，于 保存；用于表达分 析 的 组织样 品 来 自于实 验室前期保存的经 诱导乳腺炎的奶牛乳腺组织。试验试剂 试剂、逆转录试剂盒和 购自宝日医生物技术（北京）有限公司，（）购自南京诺唯赞生物科技有限公司，感受态细胞购自北京索莱宝科技有限公司，柱式凝胶纯化回收试剂盒购自 （美国）公 司，（）荧光定量试剂盒购自北京聚合美生物科技有限公司。方法 总 提取与 合成分别将健康奶牛和 诱导乳腺炎奶牛的乳腺组织块在液氮中迅速研磨，按照 试剂说明书提取组织总 ，的琼脂糖凝胶电泳检测 的完 整 性，多 功 能 酶 标 仪（）测定浓度与纯度。按照逆转录试剂盒说明书，去除总 中的基因组污染后，将总 逆转录为 ，保存，备用。引物设计与合成根据牛 基因的序 列（：），利 用 软件设计 扩增引物和 引物（表），由安徽通用生物有限公司合成，无菌无酶超纯水溶解。表引物信息 基因 引物序列（）（）退火温度 产物长度 用途 ：扩增 ：内参 奶牛 基因的 分析 浓度稀释为 ，以甘油醛磷酸脱氢酶（，）基因为内参基因，采用 技术检测 基因在健康奶牛和 诱导乳腺炎奶牛的乳腺组织中的表达。反应体系为 ，包含：，上下游引物各，。反应程序为：预变性；变性，退火，共 个循环。基因的相对表达量用 法进行 计算，数 值 用“平 均值标准误”表示。利用 和 的单因素方差分析进行组间基因表达水平的差异显著性分析，其中，表示差异显著，表示差异极显著。奶牛 基因 区克隆与测序以奶牛乳腺组织 为模板扩增 基因的编码区，反应体系为 ，包含：，模板 ，上下游引物各，。反应条件为：预变性 ，变性，退火 ，延伸 ，个循环，终延伸 ，保存。用琼脂糖凝胶电泳检测 产物；采用凝胶纯化试剂盒对产物进行纯化回 收。将 回 收 产 物 与 在 连接，并将连接产物转化至 感受态细胞中，挑选阳性菌落，进行菌液 验证后，送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。奶牛 基因 区的生物信息学分析开 放 阅 读 框 架：利 用 （：）分析 基因的开放阅读框，并根据常用密码子推导该基因所编码的蛋白质序列。蛋白结 构 特征：利 用 在 线 工 具（：）进 行 蛋白的理化性质分析；利用 在线工具（：）分析 蛋白的亲水性疏水性；利用 （：）进行磷酸化位点预测；利用（：）进行跨膜区预测；利用 （：）进行信号肽序列预测；利用 （：）和 （：）进行二级结构和三级结构预测。蛋白功能：利用 软件进行同源性西北农业学报 卷比对与系统发育树构建；利用 中 在线 工 具（：）进行结构域预测；利用 （：）进行亚细胞定位；利用 在线工具（：）进 行 蛋 白 互 作分析。结果与分析 总 提取与 合成组织 提 取完 成后，测 定 浓度，值为 ，表明 的纯度较高。的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示条带完整，未见明显降解（图），可用于后续试验。健康奶牛的乳腺组织；诱导乳腺炎奶牛的乳腺组织 ；图奶牛乳腺组织总 的电泳结果 奶牛 基因在奶牛 乳 腺 组 织 中的表达以 为内参，利用 技术检测奶牛 基因在健康和 诱导乳腺炎奶牛的乳腺组织中的表达量。结果表明，与健康奶牛相比，基因在 诱导的乳腺炎奶牛的乳腺组织中的表达量显著上调（）（图）。奶牛 基因 区克隆以 逆 转 录 的 为 模 板，扩 增 基因的 区，用凝胶电泳进行检测，结果显示条带单一，与目标片段大小一致。测序结果显示均为单峰，片段大小为 （图）。健康奶牛的乳腺组织；诱导乳腺炎奶牛的乳腺组织；代表差异极显著（）；（）图 基因在健康和 诱导乳腺炎奶牛的乳腺组织中的表达 图奶牛 基因 区 产物的电泳结果 奶牛 基因 区生物信息学分析利用 分 析 奶 牛 基 因 的开放阅读框。结果表明，基因的起始密码子为 ，终止密码子为 ，区全长为 ，编码 个氨基酸（图），分子质量为 。奶牛 蛋白结构特征分析 分子组成由 在线工具对上述 蛋白质进行分析。结果表明，组成奶牛 蛋白质的氨基酸共有 种，其中以亮氨酸（）占比最大，为 ，色氨酸（）占比最少，为（图）。氨基酸残基中，带负电期任倩倩等：奶牛 基因 区克隆、表达及生物信息学分析矩形框内为引物序列 ，图 基因编码的氨基酸序列 荷的残基总数（）为 个，带正电荷的残基总数（）有 个。亲水性疏水性奶牛 蛋白的理化性质表明，该蛋白的理论等电点为 ，总原子数有 个，原子结构为 ，不稳定指数为 ，脂溶指数为 ，平均亲水性为 ，为亲水性蛋白质（图）。图奶牛 蛋白的氨基酸组成 磷酸化位点预测用 在线工具对 蛋白的磷酸化位点进行预测。结果表明，奶牛 蛋白存在丝氨酸（）、苏氨酸（）和酪氨酸（）种氨基酸的 个磷酸化位点（阈值），其中，位点个，分别位于第、和 位；位点 个，分别位于第 、和 位；位点个，分别位于第 和 位（图），这些磷酸化位点可能与蛋白质的活性有关。西北农业学报 卷图奶牛 蛋白的亲水性疏水性分析 图奶牛 蛋白的磷酸化位点预测 高级结构用 在线工具进行 蛋 白 的 二 级 结 构 预 测。结 果 表 明，牛 蛋白的二级结构由螺旋（）、无规卷 曲（）、延 伸 链（）和转 角（）组成（图）。建立三级结构模型结果显示 蛋白为同源七聚体（图）。利用 进行跨膜结构预测 结 果 表 明，不 存 在 跨 膜 结 构 域（图）。奶牛 蛋白功能分析 结构域利用 中 （）分析 蛋白的保守结构域。结果发现，该蛋白包含 和 超家族结构域（图），表明该蛋白与典型的蛋白酶体家族成员 和 同源，可能通过上述结构域发挥激活蛋白酶体的作用。亚细胞定位与蛋白互作通过 在线工具对 基因的 区编码的蛋白进行亚细胞定位，结果显示，该蛋白 可能存在于细胞质中，存在于细胞核中，存在于线粒体中，可能在高尔基体中，表明该蛋白可能主要在细胞核和细胞质中发挥作用。此外，利用 在线工具分析蛋白质的互作网络（图），结果表明，蛋白可能与 、和 蛋白有相互作用。根据上述蛋白质的功能，推测奶牛 可能调节细胞周期、增殖凋亡、血管生成、炎症反应与抗原呈递等过程。期任倩倩等：奶牛 基因 区克隆、表达及生物信息学分析图奶牛 蛋白的二级结构预测 图奶牛 蛋白的三级结构预测 同源性利用 软件分析奶牛 蛋白与小鼠（）、人（）、牦牛（）、绵羊（）、大鼠（）和黑猩猩（）等个物种 蛋白质的同源性，发现奶牛 蛋白质与上述个物种 蛋白质序列同源性高达 ，表明各物种间 蛋白质保守性较强，可能具有相似的生物学功能。并用 软件中邻近法（，法）构建系统进化树（图），奶牛与牦牛在系统进化树中距离最近，聚为一类，与大鼠距离最远。图 奶牛 蛋白的跨膜区预测 图 奶牛 蛋白保守结构域预测 西北农业学报 卷图 奶牛 蛋白的互作分析 图 不同物种 蛋白的系统进化树 讨 论奶牛乳腺炎的预防与治疗一直以来是亟需解决的难题，乳腺组织在 和 等病原菌入侵后，白介素（，）、白介素 （，）和肿瘤坏死因子（，）等促炎细胞 因 子 的 表 达 量 上 升，发 生 炎 症 反 应。作为蛋白酶体激活 家族的成员，于 年在患有系统性红斑狼疮患者的血清中被发现，其 家 族 成 员 还 有 和 。以泛素化和 非依赖性降解下游靶蛋白的作用方式受到广泛关注，在人乳腺癌 等疾病中的作用机制是近年来的研究热点。因此，本研究采用 法检测 基因在奶牛乳腺组织中的表达模式，并通过克隆获得 基因的 区序列，采用生物信息学方法预测 蛋 白 的 生 物 学 功 能，为 进 一 步 探 讨 在奶牛乳腺炎中的调控作用提供参考。本试验采用 法检测 基因在 型奶牛乳腺炎乳腺组织中的表达量，与健康乳腺组织相比，基因在炎性组织中的表达量显著上调；等 研究表明，在 或脂多糖（，）处理过的小鼠巨噬细胞中，基因的 和蛋白水平的表达量均上调，与本研究结果一致。此外，他们还发现 可参与调控 样受体信号通路和 信号通路，与小鼠巨噬细胞炎症调节有关。等 研究发现，与 互作的 在蛋鸡传染性支气管炎症反应中表达显著 上 调，调 节 信 号 通 路。因 此，推 测 可能通过 信号通路调节奶牛乳腺组织炎性反应过程。本研究通过 基因所编码蛋白质的成分分析，发现亮氨酸占比最大（）。有报道显示，亮氨酸广泛存在于各种病毒和真核生物中，参与多种蛋白质的合成，调控机体代谢、细胞周期和免疫反应等生理过程 ，推测奶牛 蛋白有可能与上述生物学过程相关，有待于深入研究。通过对 基因编码蛋白的理化性质分析，该蛋白为较稳定酸性亲水性蛋白，且不具有信号肽序列，无跨膜结构域，是非分泌型蛋白，主要分布在细胞质和细胞核中，可能促进细胞核中蛋白质代谢的后期或在控制生物体内活性肽水平期任倩倩等：奶牛 基因 区克隆、表达及生物信息学分析中发挥特殊作用。此外，对 蛋白的磷酸化位点的预测也表明其功能的复杂性。对 基因编码蛋白的二级与三级结构分析发现，蛋白的二级结构由螺旋、无规则卷曲、延伸链和转角组成，其三级结构形成同源低聚物，由于单体螺旋之间的相互作用，使其高级结构十分稳定，这就保证 蛋白在细胞需要或特定的条件下更高效地与蛋白酶体结合并发挥作用。另外，本研究结果表明 蛋白包含 和 结构域；等 研究发现，可能来源于 基因，并且 由亚基样前体系统的基因复制产生；而 等 对果蝇来源的 亚基的研究，证实其序列和功能与典型的