木荚红豆叶总黄酮提取工艺优化及其抗氧化活性研究_郑丽鋆.pdf

木荚红豆叶总黄酮提取工艺优化及其抗氧化活性研究郑丽鋆，傅佳蕊，王 钦（.福建医科大学附属协和医院药学部，福建福州；.福建农林大学植物保护学院，福建福州）摘要：目的 为了深入探究木荚红豆叶中黄酮类化合物的最佳提取工艺及其抗氧化活性。方法依据单因素试验结果，进行响应面设计试验，探究乙醇浓度、液料比和提取时间对木荚红豆叶总黄酮提取率的影响，并进行验证实验，建立该工艺的模型。此外对最优条件下的总黄酮提取液进行体外抗氧化活性试验。结果该工艺最佳提取条件为：提取时间.、固液比.，乙醇溶液.，提取率.。抗氧化活性试验表明木荚红豆叶中黄酮类化合物具有良好的清除自由基 的能力，最高可达.。结论 优化的木荚红豆叶总黄酮提取工艺合理可行，且清除 自由基的能力较强。关键词：木荚红豆；总黄酮；响应面法；抗氧化活性中图分类号：文献标识码：文章编号：（）作者简介：郑丽鋆，女（.）。毕业于福建中医药大学中药学专业。学历：硕士研究生。职称：主管中药师。研究方向为中药药效物质基础研究。基金项目：福建省中青年教师教育科研项目（项目编号：），（.，；.，）：，.，.，.，.，.，.，.：；木荚红豆（.）为豆科植物蝶形花亚科红豆属（）常绿乔木。主要生长在我国南方地区，其木材可用做高级家具、工艺木雕，目前福建省将其作为重要的药赏两用经济树种进行推广种植。为保持良好树形和木材材质，木荚红豆需每年进行修剪，产生的大量枝叶弃于林地未被充分利用，造成枝叶资源的严重浪费。木荚红豆不仅有较高的经济和观赏价值，其药用价值也高，其根、枝、叶均可药用，近年来关于木荚红豆的化学成分及生物活性研究成为国内外的研究热点。课题组一直致力于木荚红豆的开发与利用，前期研究发现，木荚红豆叶中富含黄酮类化合物，且具有良好的抗氧化、抑菌等生物活性，。基于此，本研究通过响应面模型优化木荚红豆叶总黄酮的提取工艺，并进一步测定总黄酮抗氧化活性。旨在为新型植物源抗氧化剂的开发、木荚红豆枝叶的化学应用提供理论参考，有助于提高木荚红豆枝叶的利用率。材料与方法.材料与仪器.供试植物：木荚红豆叶：于 年 月采自树龄为 年的 年生老叶，种植基地为福建沙县红豆苗业专业合作社，干燥药材及样品标本现保存于福建农林大学自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心。取适量干燥的木荚红 .豆叶，粉碎后备用。.试验仪器：紫外可见分光光度计（岛津仪器有限公司），型数控超声波清洗机（昆山超声仪器公司），恒温循环器（北京博医康实验仪器有限公司），型恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）。.实验试剂：氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司）、硝酸铝、亚硝酸钠、无水乙醇、纯水、超纯水（实验室自制）；芦丁标准品（北京谱析公司）。.试验方法.芦丁标准曲线的绘制：芦丁与黄酮结构相似，具有相同的吸光度测试性质，因此芦丁被用作绘制标准曲线的参考物质。称取 芦丁，置于 干燥容量瓶中，加无水乙醇溶解，待标准品完全溶解后，定容，摇匀，配制.浓度的芦丁溶液备用。分别精密移取芦丁溶液.、.、.、.、.、.、.、.于容量瓶（）中，依次加入 和 （）溶液各 ，均经摇匀和静置 后，最后加入 溶液 ，用无水乙醇定容至，静置 ，最终配置成.、.、.、.、.、.、.、.、.的待测样品溶液。采取（）体系方法测定在最大吸收 处的吸光度。绘制标准曲线，并计算相关系数（）。.黄酮得率的测定：称取.木荚红豆叶粉末若干份，分别置于圆底烧瓶中，加入适量的乙醇溶剂进行提取，采用溶剂回流提取法，收集滤液，测量体积，用于计算提取率。移取.滤液，根据.项下的测定方法，用乙醇溶剂定容至 ，测定最大吸收 处的吸光值，平行测定 次，记录数值。根据.项的线性回归方程确定样品溶液的总黄酮浓度，再将其带入公式（）以计算黄酮的得率。总黄酮得率（）（）式中：总黄酮溶液浓度；稀释倍数；滤液体积；木荚红豆叶粉末的质量。.单因素实验：称取.木荚红豆叶粉末 份，置于 的圆底烧瓶中，分别加入 倍体积的 乙醇，回流提取，按.的试验方法计算在提取、时的总黄酮得率；按上述方法固定其他因素，计算不同乙醇浓度（、）和不同液料比（、）的总黄酮得率，得到不同条件下的最佳提取工艺。表 响应面试验的因素水平表水平因素 提取时间（）料液比（）乙醇浓度（）.响应面优化设计：三因素三水平试验按 原理设计，采用软件 .分析，参照.的提取方法，以总黄酮提取率为评价指标，从而获得各因素下的最优提取工艺条件（见表）。.验证试验：为确定响应面试验所得结果稳定，对响应面试验最优化的条件试验验证，重复 次。.抗氧化活性试验：参照文献，的方法，精密称量 粉末.，用乙醇定容至 容量瓶中，超声，避光保存。用最优条件提取获得的总黄酮溶液，配置成浓度为.、.、.、.、.的溶液。取.总黄酮溶液和.乙醇溶液，混匀，避光，在 处测量吸光度（）；取.无水乙醇溶液和.总黄酮溶液，混匀，作为对照组，测量 处的吸收（）；取.无水乙醇溶液和.乙醇溶液，混匀，作为空白组，测量 处的吸收（）。以维生素 为阳性对照，计算 自由基在不同浓度的总黄酮溶液和维生素 溶液中的清除率，见公式（）：清除率（）（）（）结果与分析.标准曲线的绘制 根据所得数据利用 .软件作图。试验结果表明芦丁浓度在.之间具有线性关系，得回归方程为 .，.。.单因素试验结果由图 可知，提取总黄酮时，其提取率与乙醇浓度的关系为随着乙醇浓度的增加先升高后降低，提取率在乙醇浓度为 时最高，为.；超过 时，提取率降低。根据文献报道，可能是高浓度乙醇改变了木荚红豆叶细胞膜内外的渗透压，导致膜外渗透压过高，膜内物质不能出来，所以最佳乙醇浓度为，选取浓度为、的乙醇溶液作为响应面试验的 个因素。由图 可知，提取总黄酮时，其提取率与提取时间的关系为随时间延长先升高后降低，提取率在 时达到最大值，为.。超过 ，木荚红豆叶的某些黄酮类化合物受热分解，使总黄酮提取率不断降低。所以 为最佳提取时间，将回流提取时间、作为响应面试验的 个因素。如图 所示，总黄酮的提取率随着料液比的不断增加，先升高后降低。总黄酮提取率在料液比为 时最高，为.。因此，为最佳料液比，在响应面试验中，选取料液比、作为试验的 个因素。.响应面试验设计结果.响应面分析方案及结果：运用分析工具软件 .处理实验数据（见表），得到二次回归拟合模型的方程如下：总黄酮提取率 .。.显著性分析：由表 可知，该模型显著（.），失拟项不显著（.），结果表明各因素之间的线性关系显著，实验模型可行且显著。回归模型方程项的显著性分析：一次项：、的 值分别为.、.、.，均大于.，不显著；交互项：、的海峡药学 年 第 卷 第 期 值分别为.、.、.，均大于.，不显著；二次项：不显著（.），显著（.），极显著（.）；结果表明，提取条件对总黄酮提取率的影响顺序为：提取时间（）乙醇浓度（）液料比（）。图 不同因素对总黄酮提取率的影响表 响应面试验设计及结果试验编号乙醇浓度（）提取时间（）料液比（）得率（）.表 响应面方差分析方差来源平方和 自由度均方 值 值显著度）模型.提取时间.料液比.乙醇浓度.残差.失拟.误差.总计.注：差异显著（.），：差异极显著（.）.响应面各因素交互作用：基于对响应面图和等高线图的分析，当确定 个因素水平时，其他两个因素的相互作用以及对总黄酮提取率的影响可以通过响应面图的锐度和等高线的轮廓形状来判断，。图 显示，提取时间和乙醇浓度之间的相互作用的响应曲面的坡度最陡、等高线轮廓呈椭圆形，表明总黄酮提取率受各因素交互作用影响的显著性程度为 ，与上述回归模型系数的显著性分析结果吻合。.验证试验结果通过 .软件设计出的方案进行试验，可知最佳提取工艺为提取时间.、料液比 .，.乙醇溶液，提取率.。根据操作的可行性，最终确定提取工艺为提取时间 ，料液比 ，乙醇溶液，进行三次重复试验，以验证结果的可靠性。结果表明，木荚红豆叶总黄酮提取率为.，实际值与预测值接近，表明该模型准确可靠，重现性好，因此该提取条件为木荚红豆叶总黄酮的最优提取工艺参数。.抗氧化活性试验结果如图 所示，自由基清除率随着总黄酮浓度的增加而增加，浓度为.时达到最大，为.。使用 .软件拟合图 中的两条曲线，计算拟合回归方程，其 值为.，而阳性对照 的 值为.。可见，在相同浓度下，总黄酮发挥清除 自由基的能力略低于，具有较强的抗氧化活性。讨论木荚红豆作为珍贵的用材树种，其枝叶资源不仅浪费严重，还易造成环境污染，为提高木荚红豆树枝叶资源的利用率，本研究首次采用响应面法优化了木荚红豆叶总黄酮提取工艺，并测定其体外抗氧化活性。结果表明，最佳提取条件为：乙醇浓度.、料液比 .、提取时间.，总黄酮提取率为.，接近预测值，表明该工艺优化条件准确可靠，重现性良好。在最佳条件下对总黄酮提取物进行了体外抗氧化活性测试，结果表明，木荚红豆叶总黄酮提取物清除 自由基的能力随浓度的增加而增加，当浓度为.时，清除率达到最大，为.。可见，.木荚红豆叶总黄酮具有较强的抗氧化作用，其体内外的抗氧化活性、作用机制及发挥作用的物质基础有待后续的深入研究，以期充分利用废弃枝叶资源，变废为宝，为新型植物源抗氧化剂的开发提供理论基础。图 交互效应响应面图及等高线图图 木荚红豆总黄酮和维生素 清除 自由基能力图参考文献朱仕芳.木荚红豆树育苗技术研究.安徽农学通报，（）：.李倩.花榈木及木荚红豆组织培养技术初步研究.华南农业大学，.陈艳伟.红豆树与木荚红豆种子生物学特性及贮藏生理生态.贵州大学，.王钦，陈啸，阮诗琪，等.木荚红豆叶中 个新的木脂素.中草药，（）：.张琳婧，周文娟，倪林，等.红豆属植物化学成分及其药理活性研究进展.中草药，（）：.王钦，陈啸，阮诗琪，等.木荚红豆叶中 个新的木脂素.中草药，（）：.，.，（）：，朱仕豪，凌智辉，张湘龙，等.花榈木叶黄酮类化合物提取纯化工艺优化.湖南农业科学，（）：.海峡药学 年 第 卷 第 期马金魁，黄晓辰，张佳仪，等.响应面法优化辣木叶总黄酮提取工艺及其抑菌性研究.食品研究与开发，（）：.朱瑜，吴建华，杨剑，等.辣蓼黄酮分离提取及 种黄酮类组分定量分析.辽宁中医药大学学报，（）：.曹坤.棉团铁线莲中黄酮及三萜类成分分离纯化和生物活性研究.成都大学，.王俊青，汪全，焦阳阳，等.响应面法优化南方红豆杉叶总黄酮提取工艺研究.食品研究与开发，（）：.黄琪，李丽丽，吴德玲，等.响应面法优选知母须根总黄酮提取工艺及其解热作用研究.天然产物研究与开发，（）：.李燕，赵天明，黄丽荣，等.响应面法优化响铃草总黄酮提取工艺及体外抗氧化活性研究.食品研究与开发，（）：.左龙亚，郭冬琴，周浓，等.属 种 真菌增殖技术的初步研究资源开发与市场，（）：.袁雪艳，黄维，陈泽明，等.圆齿野鸦椿花青素提取工艺优化及抗氧化活性评价.福建农林大学学报（自然科学版），（）：.杨娟，杨立志，邱铭锰，等.珍稀食用菌的抗氧化性评价及筛选.福建农林大学学报（自然科学版），（）：.，.，（）：.郭雪峰，岳永德.黄酮类化合物的提取分离纯化和含量测定方法的研究进展.安徽农业科学，（）：.全颖萱，黄冰冰，贝佳炎，等.红豆树叶总黄酮提取工艺优化及抗氧化性研究.中国野生植物资源，（）：.范三红，王娇娇，白宝清，等.响应面法优化辣椒油树脂提取工艺及其抗氧化和抑菌性研究.中国食品添加剂，（）：.茯苓块中混入山药加工品的鉴别丁光俊，郭燕玲（福建省妇幼保健院，福建医科大学妇儿临床医学院，福建福州）摘要：目的 对茯苓与山药加工品进行鉴别，以保证临床用药品种正确、用量准确。方法 采用来源、性状、显微、理化等鉴定方法进行区别比较。结果 茯苓与山药在来源、性状、显微、理化等方面有显著差别。结论 本方法简单易行，可作为中药材商品流通以及临床应用中药质量控制的一种鉴别方法。关键词：茯苓；山药；来源；性状；显微；理化鉴别中图分类号：文献标识码：文章编号：（）作者简介：丁光俊，男（）。职称：副主任药师。研究方向为中药鉴定。，（，）：，.，.，.，.：；茯苓，始载于神农本草经，列为上品，据历代本草记载及图经本草、本草纲目等附图，从古至今茯苓药用品种相同，其来源于多孔菌科真菌茯苓 的干燥菌核。具有利水渗湿、健脾宁心