柠檬酸交联固定化小球藻复合材料的制备及药物缓释性能_李豪.pdf

doi:10.16865/ki.1000-7555.2022.0280收稿日期：2022-05-02基金项目：国家自然科学基金资助项目（Z2202016）；陕西省自然科学基础研究计划（2021SF-497，2022TD-04）；中央高校基本科研业务费专项资金（300102290103，300102291403，300102292903）；陕西省水利厅项目(2015slkj-02)通讯联系人：罗钰，主要从事生物质资源化再利用研究，E-mail:高分子材料科学与工程POLYMER MATERIALS SCIENCE AND ENGINEERING第38卷第12期2022年12月Vol.38,No.12Dec.2022近年来，药物输送载体的研究开发受到广泛关注。大量天然和合成聚合物，如明胶、壳聚糖和聚乙烯凝胶，被制备成各种形式作为药物输送的载体，以适应不同需求1。而生物质材料具有优异的生物相容性、生态友好性和生物降解性等优点，用于药物载体有巨大的应用潜力2。使用生物材料构建的复合材料具有独特的物理/化学性质，为设计和开发新的药物载体开辟了新的窗口。小球藻是一类单细胞绿藻，分布广泛且种类很多，生长繁殖快，应用广泛3。小球藻细胞壁主要由纤维素、蛋白质和脂质组成，这些生物大分子为小球藻表面带来了丰富的官能团，包括羧基（COOH）、羟基（OH）、氨基（NH2）和酰胺基（CONH2）等4,5，这些官能团不仅提供了必要的亲水性，还可以作为反应位点被进一步修饰，以调整其化学性质，这些优点使小球藻成为了理想的基体材料。但小球藻的细胞很小，难以与水分离，容易引起二次污染，限制了小球藻的直接应用。因此，需要选择合适的方法对小球藻细胞进行固定化及改性。柠檬酸是一种天然有机酸，普遍存在于各种水果中。柠檬酸作为天然防腐剂、酸度调节剂和抗氧化剂被广泛用于食品工业和制药业6,7。柠檬酸的生产是通过发酵进行的，全球柠檬酸的年产量约73.6 万吨6。柠檬酸是三元羧酸，化学结构中有 3 个羧基和 1 个羟基，柠檬酸的 3 个羧基可以与生物材料的自由羟基反应形成酯键。鉴于这些特点，化学修饰被作为柠檬酸的一种新用途，以赋予天然生物材料新的化学和物理功能，因此，柠檬酸也作为交联剂应用在天然高分子材料上8。例如，Xing 等以柠檬酸为交联剂，在高温下对复合纳米纤维中的壳聚糖分子进行交联，提高了纳米纤维的耐溶剂性，并且可以通过调节热处理温度来控制复合纳米纤维的药物释放性能9。本文以天然生物材料小球藻为基体、柠檬酸为交联剂，制备了低毒性且完全可生物降解的柠檬酸固定化小球藻复合材料（ChlorellaCA）。系统地研究了柠檬酸固定化小球藻复合材料的表面属性，如http:/柠檬酸交联固定化小球藻复合材料的制备及药物缓释性能李豪1，白波1，裴柯1，罗钰1，梁琳琳1，王贺铭1，彭可慧1，曹芳利2（1.长安大学 旱区地下水文与生态效应教育部重点实验室，陕西 西安 710054；2.陕西建工安装集团有限公司，陕西 西安 710054）摘要：天然小球藻具有独特的理化/生物特性，通过柠檬酸对小球藻进行热化学改性，制备了一种新型复合材料，并将其用作酮洛芬的药物缓释载体。通过红外光谱和扫描电镜分别对合成的柠檬酸交联固定化小球藻复合材料的结构和表面形貌进行表征，提出了材料的合成机理。研究了不同反应温度下合成的复合材料的羧基含量、酯化率、等电荷点等表面属性，确定140 为最佳的反应温度。此条件下制备的复合材料具有最大的吸水倍率（为35.8 g/g），并对溶胀介质的pH敏感。以酮洛芬为模板药物，研究了柠檬酸交联固定化小球藻复合材料的药物负载性能及在模拟体内环境下的缓释性能，结果表明，pH=1.2和pH=6.8时，经8 h的酮洛芬的累积释放率分别为93.8%和79.7%，该聚合物对抗炎类药物有缓释作用，在智能药物输送方面具有潜在的应用前景。关键词：固定化技术；水凝胶；溶胀；药物负载；缓释中图分类号：TQ460.4文献标识码：A文章编号：1000-7555（2022）12-0085-08高分子材料科学与工程2022年李豪等：柠檬酸交联固定化小球藻复合材料的制备及药物缓释性能第12期羧基含量、酯化率和零电荷点，以进一步验证材料的合成过程。考察了热反应温度和外部溶液 pH 对复合材料吸水性能的影响，探究了复合材料对酮洛芬的负载和缓释性能。1实验部分1.1试剂与原料小球藻粉：食品级，西安圣青生物科技有限公司；柠檬酸、氢氧化钠：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；酮洛芬：98%，北京百灵威科技有限公司；无水乙醇、丙酮：分析纯，上海阿拉丁生化科技有限公司；溴化钾：光谱纯，上海吉至生化科技有限公司。1.2制备过程通过化学交联法对小球藻进行固定化。称取 5g 的柠檬酸溶解于 20 mL 去离子水中，加入 2 g 小球藻粉末与柠檬酸溶液混合，充分搅拌使其均匀混合。将混合溶液转移到坩埚中，置于烘箱中于55 脱水干燥 3 d，直至混合物表面的水分被蒸发到半干状态时，小球藻被完全包裹于柠檬酸中。之后调节烘箱温度，在特定温度（110，120，130，140 和 150）持续反应 3 h 得到反应产物。将产物用去离子水和丙酮交替洗涤，直至中性，得到柠檬酸交联固定化小球藻复合材料，烘干并研磨粉碎备用。1.3测试与表征1.3.1样品的结构表征：称取一定量的柠檬酸固定化小球藻复合材料样品，加入适量溴化钾，研磨后进行压片，使用傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR，Spectrum two，美国珀金埃尔默仪器有限公司）进行红外光谱表征。测定的波数范围为 5004000 cm1、扫描次数32次、分辨率为4 cm-1。1.3.2样品的形貌表征：取适量样品于载物台上进行喷金处理，通过扫描电子显微镜（SEM，Hitachi S-4800，日本日立有限公司）观察样品的表面形貌，扫描电压为20.0 kV。1.3.3羧基含量的测定：通过酸碱滴定法测定复合材料的羧基含量。准确称取 2.0 g 样品溶于 0.1 mol/L 的 NaOH 溶液中，使其充分反应。以酚酞为指示剂，用 0.1 mol/L 的盐酸滴定溶液中剩余的 NaOH。每 100 g 样品中的羧基含量（W，单位 mmol/kg）按式（1）计算W=(V0V1)Cm（1）式中：V1和 V0分别为有、无样品时滴定所需要的HCl溶液体积，mL；C滴定使用的盐酸溶液的浓度，mol/L；m溶解的样品质量，g。1.3.4酯化率的测定：通过滴定法测定柠檬酸固定化小球藻复合材料的酯化率，酯化率的测定包括酯键的完全碱性水解和过量碱的电位滴定。准确称量 1.0 g 柠檬酸固定化小球藻样品，加入 50 mL 的75%乙醇溶液混合均匀，在 50 下水浴加热 0.5h。待溶液冷却后，加入 25 mL 的 0.5 mol/L NaOH 溶液，在室温下搅拌 72 h 使其完全反应。以酚酞为指示剂，用 0.5 mol/L 盐酸反滴定过量的碱。以同样的方法进行空白对照和重复样品的处理。样品的酯化率（E）按式（2）计算：E=(V0V1)CM158（2）式中：V1和 V0分别为有、无样品时滴定所需盐酸 的 体 积，mL；C盐 酸 溶 液 的 浓 度，mol/L；M样品的质量，g；158柠檬酸脱去 2 个 OH后的相对分子质量。1.3.5Zeta 电位的测定：称取少量柠檬酸固定化小球藻复合材料样品溶解于水中，配置成溶液，通过滴加 HCl 和 NaOH 溶液调节溶液的 pH，得到 pH 为29 的溶液，使用英国 Malvern Zetasizer Nano ZS90电泳仪测定样品的Zeta电位。1.3.6吸水率的测定：通过质量法测定柠檬酸固定化小球藻样品的吸水率。称取一定质量的样品，放入过量去离子水中吸水溶胀 2 h。用金属筛网将溶胀后的样品分离出来，静置一段时间以除去表面未吸收的水。样品的吸水倍率（Qe）按式（3）计算100emmQm-=（3）式中：Qe溶胀平衡时样品的吸水率，g/g；m0，m1分别为样品吸水前和吸水后的质量，g。样品在不同 pH 的缓冲溶液中的吸水率按照同样的方式测定。1.3.7药物负载率和释放率测试：以柠檬酸固定化小球藻复合材料为载体，将酮洛芬作为模板药物来研究药物负载与控释。首先将酮洛芬溶解于无水乙醇中，配置成 20 mg/mL 的溶液。称取 2 g 样品加入100 mL酮洛芬溶液进行药物负载，将混合液放在摇床中摇动 4 h，达到平衡状态。每隔一定时间，取3 mL 溶液用紫外可见分光光度计测定其在 275 nm波长处的吸光度10，将负载过药物的样品与溶液分离并干燥，用于药物释放实验的测试。按式（4）计86高分子材料科学与工程2022年李豪等：柠檬酸交联固定化小球藻复合材料的制备及药物缓释性能第12期算酮洛芬的负载率（LC）LC=C0CtC0（4）式中：C0和 Ct分别为载药前后酮洛芬溶液的浓度，mol/L。药物释放使用的柠檬酸固定化小球藻复合材料来自药物负载实验结束后重新干燥的样品，体外模拟缓释的介质为pH=1.2的HCl溶液和pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液。精确称取一定质量负载酮洛芬的干燥样品，分别置于 200 mL 2 种释放介质中，在 37 的恒温摇床中进行药物缓释。每隔一段时间，取 5mL 溶液测定其吸光度，并补充相同体积的释放介质以保持体积恒定。药物释放率（RP）按式（5）计算RP=mtm0（5）式中：mtt 时刻时被释放出来的药物质量，g；m0样品中负载的药物总质量，g。2结果与讨论2.1材料的制备机理Fig.1 为柠檬酸交联固定化小球藻的制备机理示意图。柠檬酸是具有 3 个羧基的多元羧酸，多元羧酸会先脱水形成环状酸酐然后交联成酯，因此，柠檬酸上的 3 个羧基最多与 2 个自由羟基反应，在 2个聚合物分子间或同一分子间形成 2 个酯键11。小球藻的细胞壁上具有大量的亲水性基团，当小球藻与柠檬酸的混合物被加热到半干状态，在氢键作用下，小球藻被大量的柠檬酸包裹。当温度升高到100 以上，柠檬酸相邻的 2 个羧基脱水形成活性酸酐，其中一个羧基与小球藻表面的羟基发生酯化反应，另一个羧基被释放出来；当中间的羧基被释放出来时，它与第3个羧基继续脱水形成酸酐，从而再与羟基发生交联12。通过这种方式，柠檬酸将小球藻细胞连接起来，形成了三维交联网络结构。Fig.2 FT-IR spectra of(a)Chlorella,and(bf)citric acidcrosslinking immobilized Chlorella composites at reactiontemperatures of 110,120,130,140 and 150,respectively2.2材料的结构分析为了研究柠檬酸与小球藻之间的相互作用，测定了小球藻和柠檬酸交联固定化小球藻复合材料的 FT-IR 光谱，如 Fig.2 所示。对于小球藻，3291 cm1处的宽峰可归因于分子间羟基的伸缩振动，而 1241cm1处的峰归因于 CO 伸缩振动，表明小球藻上Fig.1 Formation mechanism of citric acid crosslinking immobilized Chlorella composites87高分子材料科学与工程2022年李豪等：柠檬酸交联固定化小球藻复合材料的制备及药物缓释性能第12期存在丰富的羟基和羧基13。此外，1658 cm1，1546cm1和 1401 cm1处的吸收峰分别来自 C=O 伸缩振动（酰胺）、NH 弯曲振动（酰胺）和 CN 吸收带（酰胺）5。在谱线（bf）经过柠檬酸热化学处理过后，3291 cm1处的特征峰转移到 3273 cm1处并明显减弱，1658 cm-1处的峰减弱，1241 cm1处的峰偏移到 1173 cm1处，这些变化表明，小球藻细胞壁表面的羟基通过酯化反应与柠檬酸发生了交联。此外，在 1707 cm1和 1388 cm1处产生的新的吸收峰，分别对应酯基的 C=O 伸缩振动和 COO伸缩振动，也证实了这一反应。也就是说，柠檬酸与小球藻细胞壁上的羟基发生反应，生成