磷酸肌酸钠预处理对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用_王亚光.pdf

14Wang Y，Tai Q，Zhang J，et al MiNA-206 inhibits hepatocellularcarcinoma cell proliferation and migration but promotes apoptosis bymodulating cMET expression J Acta Biochim Biophys Sin，2019;51(3):243-5315Zhang Z，Yu X，Zhou B，et al Circular NA circ_0026359 enhancescisplatin resistance in gastric cancer via targeting mi-1200/POLD4pathway J Biomed es Int，2020;2020:51032722021-12-10 修回(编辑王一涵)磷酸肌酸钠预处理对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用王亚光1钟一2高利丽3蔡宏宇1(锦州医科大学附属第一医院1 心内科，辽宁锦州121001;2 内分泌与代谢疾病科;3 肾内科)摘要 目的研究磷酸肌酸钠预处理在急性肺缺血再灌注损伤(LII)中的作用，并探讨其作用机制。方法32 只雄性清洁级 SD 大鼠，随机均分成为 Sham 组、Sham+磷酸肌酸钠组、LII 组、LII+磷酸肌酸钠预处理组各 8 只。观察各组肺功能、肺组织学病理检查、肺水肿、氧化应激、炎症反应和凋亡染色，探讨磷酸肌酸钠预处理对肺的保护作用。结果磷酸肌酸钠预处理在大鼠肺缺血再灌注损伤中可显著降低肺组织病理学改变，明显改善肺功能，减轻肺水肿程度，肺组织中丙二醛(MDA)和髓过氧化物酶(MPO)含量下降表达，而超氧化物歧化酶(SOD)活性显著升高，降低支气管肺泡灌洗液的炎症介质表达，降低肺组织细胞凋亡率。结论磷酸肌酸钠预处理能够减轻大鼠 LII，其可能的肺保护机制即是通过抑制活性氧生成和减少肺组织凋亡和抑制炎症介质有关。关键词 磷酸肌酸钠;缺血再灌注损伤;预处理中图分类号 965.2 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0726-05;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.053通信作者:蔡宏宇(1980-)，男，主治医师，硕士，主要从事心肌与肺组织的缺血再灌注损失研究。第一作者:王亚光(1990-)，男，住院医师，博士，主要从事心肌与肺组织的缺血再灌注损失研究。肺缺血再灌注损伤(LII)常导致移植后原发性移植物功能障碍(PGD)，是导致移植后发病和死亡的主要原因1。许多接受肺动脉血栓内膜切除术和体外循环的患者或那些从镰状细胞肺危象中恢复过来的患者也会有某种形式的 LII。通过再灌注，形成活性氧，激活细胞内的一系列有害 效应2，3。肺移植后缺血再灌注迅速激活先天免疫系统促进炎症与损伤。LII 涉及供体肺细胞与受血者免疫细胞之间复杂的炎症通讯，导致危及生命的水肿、器官功能障碍和细胞死亡4。由于缺血预处理涉及机械损伤及伦理，相比较而言，药物预处理是更为理想的治疗方法，因为它不仅无创、安全，最重的是能有效减轻肺缺血再灌注损伤，因而具有非常广阔的临床应用前景。磷酸肌酸作为细胞内的能量载体，能够维持细胞的活性及基本功能5。外源性磷酸肌酸作为重要的能量补充剂，在治疗能量供应不足导致的机体病理变化中发挥着重要作用。此外，磷酸肌酸的膜稳定作用、抗氧化作用、神经保护作用等正逐渐被证实6，7。本研究旨在探讨磷酸肌酸钠预处理对大鼠肺 LII 的保护作用。1材料与方法1.1材料健康雄性 SD 大鼠 32 只，体重 250 300 g，由锦州医科大学实验动物中心提供，显微镜装置购于日本 OLUMPUS 公司，全自动血气分析，购于美国 Nova biomedical 公司，多功能酶标仪，购于瑞士 TECAN 公司，酶标仪，购于美国 BIOTEK 公司，双垂直蛋白电泳仪、凝胶成像系统购于北京六一公司。总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)试测定试剂盒，肿瘤坏死因子(TNF)-、大鼠白细胞介素(IL)-1 ELISA 检测试剂盒。髓过氧化物酶(MPO)试剂盒，购于南京建成公司。注射用磷酸肌酸钠购于海口力奇制药股份有限公司。1.2大鼠肺缺血再灌注模型大鼠术前自由进食，自由饮水，在 22C 下，12 h 光/12 h 暗周期，湿度为65%，可 自 由 获 取 食 物 和 水，20%乌 拉 坦(500 l/100 g)麻醉，仰卧位固定于手术台上，常规剪毛、消毒、铺巾，取颈前正中切口 3 cm，逐层切开分离颈前皮下组织及颈前肌肉组织，暴露、游离气管，14 G 静脉留置导管气管插管，接小动物呼吸机，呼吸机参数设置为呼吸频率 80 次/min，吸呼比 1 2，潮气量8 ml/kg，右颈静脉注射肝素(100 IU/kg)抗凝。待动物呼吸稳定后，取左侧胸部第 5 肋间隙前外侧切口，切开胸壁皮肤后，切断胸壁肌肉逐层进胸，打开胸腔，精细游离并暴露左侧肺门，以无损伤血管夹夹闭左肺门45 min 后开放(阻断后肺塌陷，颜627中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷色变为暗紫色，开放后再次膨胀，颜色变为淡红色)。再灌注120 min，实验全部结束后，采用安乐死的方法处死大鼠(静脉注射3 倍麻醉剂量的乌拉坦)。1.3实验分组健康雄性 SD 大鼠，32 只，体重250 300 g，由锦州医科大学实验动物中心提供，10 15 周龄，分笼饲养，自由喂水，统一批次，按笼分层随机均分为 Sham 组、Sham+磷酸肌酸钠组、LI-I 组、LII+磷酸肌酸钠预处理组各 8 只。尼可地尔粉剂 80 mg 充分溶解于 100 ml 蒸馏水中。Sham组:只进行假手术，开胸后仅游离肺门，不做夹闭处理，其他操作同模型组。Sham+磷酸肌酸钠组:实验大鼠进行假手术，并以 40 mg/kg 的磷酸肌酸钠予以大鼠尾静脉注射。LII 组:以无损伤血管夹夹闭左肺门 45 min 后开放(阻断后肺萎缩，变为暗紫色，开放后肺迅速膨胀，颜色恢复淡红色)，再灌注120 min后静脉取血，处死大鼠并收集肺组织。LII+磷酸肌酸钠预处理组，实验大鼠在 LII 的操作前15 min 以40 mg/kg 的磷酸肌酸钠予以大鼠尾静脉注射。1.4检测肺组织病理学2 h 再灌结束后，苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理学变化9。肺损伤评分标准见表 1。表 1肺损伤评分表参数每项得分的分类012A 肺泡间隙中性粒细胞没有1 55B 间质间隙中性粒细胞没有1 55C 透明膜没有11D 肺泡中充满蛋白质的碎片没有11E 肺泡间隔增厚22 44得分=(20A)+(14B)+(7C)+(7D)+(2E)/(视野数 100)1.5血气分析检测及氧合指数(OI)和呼吸指数(I)的计算再灌注120 min 后，各组大鼠取动脉血，测氧分压(PaO2)，二氧化碳分压(PaCO2)和 pH 值。OI=PaO2/吸氧浓度(FiO2)。I=肺泡动脉氧分压差(P(Aa)DO2)/PaO2。P(Aa)DO2=(大气压PH2O)FiO2PaCO2/PaO2。其中 PH2O 为蒸汽压，取恒值47 mmHg，=0.8，大气压统一采用760 mmHg。1.6肺干湿比重(W/D)的测定首先，大鼠安乐死后采集肺组织，在磷酸盐缓冲液(PBS)中短暂冲洗，擦拭，然后称重以获得湿重。在80干燥72 h后测定肺的干重，以湿体重除以干体重来计算 W/D。1.7MDA、SOD 的检测取组织进行准确称取，然后按重量(g)体积(ml)=19的比例加入9 倍的生理盐水，冰浴条件下机械匀浆，2 500 r/min，离心10 min，制备成10%的匀浆上清液。将组织匀浆上清进行蛋白含量测定。使用 MDA、SOD 试剂盒测定其含量。1.8肺泡灌洗液 TNF-、IL-1 的测定2 h 再灌注结束，收集肺泡灌洗液，离心后保存于20冰箱中至实验使用，肺泡灌洗液 600 g 经过 800 r/min 离心 10 min 去除沉淀物。按照试剂盒说明，TMB 显色液显色，酶标仪 450 nm 读取吸光值，以标品浓度(pg/ml)为纵坐标，对应光密度(OD)为横坐标，运用 Curve Exert1.3 软件来画标准品的线性回归曲线，然后按曲线方程来算出各样本的浓度值。1.9MPO 活性的测定冰浴的条件下进行机械的匀浆，制备成 10%匀浆，按照试剂盒说明操作。MPO 的活力(U/g 组织湿重)=(测定 OD 值对照OD 值)/11.3取样量(g)。1.10肺组织中细胞凋亡的测定用末端脱氧核苷酸转 移 酶 介 导 的 dUTP-生 物 素 缺 口 末 端 标 记(TUNEL)染色来检测肺凋亡率。1.11统计学方法采用 SPSS13.0 软件进行方差分析、Dunn 检验。2结果2.1肺组织病理学变化2 h 再灌注结束后，用HE 染色测定肺组织损伤的组织学证据。Sham 组及Sham+磷酸肌酸钠组肺组织结构及肺泡完整，肺间隔无明显增厚，无炎性细胞浸润;LII 组肺组织结构发生明显改变，肺泡堵塞，肺泡形态不完整，大量血液渗出，炎性细胞大量浸润且分布广泛，部分集结成团;LII+磷酸肌酸钠预处理组肺组织结构仍有一定变化，肺间隔增厚，有血液渗出，可见部分炎性细胞浸润。见图 1。与 Sham 组比较，Sham+磷酸肌酸钠组肺质伤评分(0.1280.025)分 差异无统计学意义。LII 组肺损伤评分(0.4280.026)分 明显高于 Sham 组(0.1220.022)分，P0.01。LI-I+磷酸肌酸钠组肺损伤评分(0.3110.029)分明显低于 LII 组(P0.01)。2.2血气分析检测及 OI 和 ISham 和 Sham+磷酸肌酸钠组 pH、PO2、PCO2、OI、I 无显著差异(P0.05)。LII 组 PaO2、OI 明显低于 Sham 组，PaCO2、I 明显高于 Sham 组(P0.01)。LII+磷酸肌酸钠组 PaO2、OI 均显著高于 LII 组，PaCO2、I 显著低于 LII 组(均 P0.05)。见表 2。2.3W/D与 Sham 组比较，Sham+磷酸肌酸钠组W/D 无明显差异(4.3140.312 vs 4.3320.279，P0.05)。与 LII 组相比，LII+磷酸肌酸钠组 W/D显著降低(5.1930.342 vs 6.2310.298，P0.01)。727王亚光等磷酸肌酸钠预处理对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用第 3 期2.4氧化应激系统的检测与 Sham 组比较，Sham+磷酸肌酸钠组 MDA、SOD 含量无明显差异(P0.05)，LII 组 MDA 含量明显升高，SOD 含量明显降低(均 P0.01)。与 LII 组相比，LII+磷酸肌酸钠组肺组织中 MDA 含量明显降低，SOD 含量明显升高(均 P0.01)。见表 2。2.5肺泡灌洗液 TNF-、IL-1 的测定与 Sham组比较，Sham+磷酸肌酸钠组肺泡灌洗液中 TNF-、IL-1 含量无明显差异(P0.05)，LII 组肺泡灌洗液中 TNF-、IL-1 含量明显升高(P0.05)。与 LI-I 组相比，LII+磷酸肌酸钠组肺泡灌洗液中 TNF-、IL-1 浓度明显降低(P0.05)。见表 3。图 14 组肺组织(HE 染色，100)表 2各组血气分析和呼吸参数及 MDA、SOD 水平比较(xs，n=8)组别pHPaO2(mmHg)PaCO2(mmHg)OIIMDA(nmol/mg)SOD(U/mg)Sham 组7.310.11208.2238.1123.484.51296.9054.431.310.528.8081.4534.6950.235Sham+磷酸肌酸钠组7.330.12202.6931.9722.752.62288.1445.621.410.478.7671.8784.6850.324LII 组7.190.13106.5221.261)35.212.041)152.5830.431)3.360.7