陆地棉GhCEF-G基因家...定及在种子萌发中的功能分析_司爱君.pdf

第 46 卷第 1 期2023 年 1 月河 北 农 业 大 学 学 报JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL UNIVERSITYVol.46 No.1Jan.2 0 2 3陆地棉 GhCEF-G 基因家族鉴定及 在种子萌发中的功能分析司爱君1,2，陈 斌1，王志城1，陈丽婷1，张 艳1，王省芬1（1.河北农业大学 河北省作物种质资源重点实验室/农学院，河北 保定 071000；2.新疆农垦科学院 棉花研究所/农业部西北内陆棉区棉花生物学与遗传育种重点实验室，新疆 石河子 832000）摘要：延伸因子 G（EF-G）是蛋白质生物合成过程中肽链延长必需的调节因子之一，对叶绿体编码蛋白的翻译至关重要。本研究以陆地棉新陆早 28 号基因组数据为参考，运用生物信息学对 GhCEF-G 家族成员的染色体定位、基因结构、保守结构域和顺式元件进行了分析，并基于前期关于种子萌发性状的 GWAS 分析，从陆地棉鉴定并克隆得到叶绿体延伸因子 GhCEF-G06 基因。结果显示，陆地棉 GhCEF-G 基因家族包含 19个成员，其编码区由 2 21 个外显子组成，编码蛋白含有 6 个保守基序，保守性较强；GhCEF-G 基因上游 2 kb 序列中存在激素及逆境胁迫响应等顺式作用元件。GhCEF-G06 基因开放阅读框全长 2 352 bp，编码 783个氨基酸，蛋白的分子量为 86.31 kD，理论等电点为 5.54，属亲水性氨基酸；转录组数据的基因表达量热图显示，GhCEF-G06 基因在吸胀后种子的子叶和根中高表达；qRT-PCR 分析表明，GhCEF-G06 基因在新陆早 28 号种子吸胀时期的表达量较高。进化关系分析表明，GhCEF-G06 氨基酸序列与同为锦葵科的木槿氨基酸序列相似性最高，其次是锦葵目的榴莲与可可。GhCEF-G06 基因过表达拟南芥的表型鉴定显示，转基因植株的萌发和幼苗生长速度比野生型慢；经夫西地酸（Fusidic acid，FA）处理后，转基因植株萌发恢复正常。陆地棉 GhCEF-G 基因家族成员的鉴定及功能分析为深入解析 GhCEF-G 调控棉花种子萌发的分子机制提供重要参考。关 键 词：陆地棉；延伸因子；种子萌发；表达中图分类号：S188 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：文献标志码：AGenome-wide identification of GhCEF-G gene family in Gossypium hirsutum and functional analysis in seed germinationSIAijun1,2,CHENBin1,WANGZhicheng1,CHENLiting1,ZHANGYan1,WANGXingfen1（1.Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Hebei/College of Agronomy,Hebei Agricultural University,Baoding 071000,China;2.Cotton Research Institute,Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science/Key Laboratory for Cotton Biology and Genetic Breeding of Northwestern Inland Region,Ministry of Agriculture,Shihezi 832000,China）Abstract:Elongation factor G(EF-G)is one of the necessary regulators for peptide chain elongation during protein biosynthesis,which is crucial for the translation of chloroplast-encoded proteins.In this study,the chromosome 收稿日期：2022-07-11基金项目：国家棉花产业技术体系项目（CARS-15-03）；河北省重点研发计划项目（21326314D）.第一作者：司爱君（1981），女，河南开封人，博士研究生，副研究员，主要从事棉花遗传育种研究.E-mail:通信作者：王省芬（1970），女，河北藁城人，博士，教授，主要从事棉花遗传育种与分子生物学研究.E-mail:本刊网址：http:/文章编号：1000-1573(2023)01-0022-09DOI：10.13320/ki.jauh.2023.00423第 1 期localization,gene structure,conserved domains and cis-elements of GhCEF-G family members were analyzed via bioinformatics based on the genomic data of Gossypium hirsutum Nongdamian8.Then the chloroplast elongation factor GhCEF-G06 was identified and cloned from upland cotton for functional study according to our previous GWAS analysis of seed germination traits.The results showed that the GhCEF-G gene family contained 19 members,and the gene coding region was consisted of 2-21 exons.The GhCEF-G proteins had six highly conserved motifs.The 2 kb upstream sequences of GhCEF-G genes contained cis-acting elements of hormone and stress responses.The length of open reading frame of GhCEF-G06 was 2 352 bp encoding a hydrophilic protein with 783 amino acids.The molecular weight of GhCEF-G06 protein was 86.31 kD,and its theoretical isoelectric point was 5.54.The expression analysis using transcriptome data showed that GhCEF-G06 was highly expressed in the cotyledons and roots of imbibitional seeds.The qRT-PCR analysis showed that the expression of GhCEF-G06 was higher during the imbibition stage of Xinluzao 28 seed.Phylogenetic analysis showed that GhCEF-G06 protein sequence shared the highest similarity to homology in hibiscus that is also in the mallow family.It also similar to homologies in durian and cocoa in the mallow order.Phenotypic identification of GhCEF-G06 over expressed Arabidopsis showed that germination and seedling growth of transgenic plants were slower than wild-type plants.The seeds of the transgenic plants germinated normally as wild-type when treated with fusidic acid(FA).The identification and functional analysis of GhCEF-G provided a reference for further analysis of the molecular mechanism of GhCEF-G genes regulating cotton seed germination.Keywords:Gossypium hirsutum L.;elongation factor;seed germination;expression延伸因子（Elongation factor，EF）调控细胞蛋白质生物合成过程中多肽链的延伸，在植物中分为EF1 和 EF2，EF 催 化 GTP 水 解，使 tRNA-mRNA复合物从核糖体 A 位转移到 P 位以及脱酰基-tRNA从 P 位点转移到 E 位点，从而促进 mRNA-(tRNA)2复合物的转位1，此外它还能结合核糖体循环因子（Ribosome recycling factor,RRF）参与核糖体的再循环过程，保证下一轮蛋白质合成的顺利进行，夫西地酸（Fusidic acid，FA）作为抑制剂可结合EF-G 并阻断蛋白质的合成2。叶绿体延伸因子（cEF-G）对于叶绿体编码蛋白的翻译至关重要。豌豆中的 cEF-G 在叶绿体生物发生的早期被诱导，其活性在光照期间增加3。在大豆中，cEF-G 被报道与细菌 EF-G 非常相似4，因为叶绿体是在内共生事件中从细菌遗传而来5-6。绿藻中的 cEF-G 与 PRK、PsbO 作为温度控制开关共同调控光合作用过程7。在拟南芥中，编码叶绿体延伸因子 G 的 SCO1 基因为植物生长所必需，在萌发早期的原生质体转变为叶绿体的过程中必不可少8。拟南芥 SCO1 突变会导致叶绿素缺乏，从而使幼苗子叶呈淡绿色到白色，并且伴随着种子萌发和发育的延迟9。此外，在油菜种子萌发和活力相关性状的研究中也鉴定出包含 SCO1 在内的候选基因，在油菜种子萌发和幼苗生长中发挥着重要作用10。目前，尽管多种植物例如大豆4、豌豆3、拟南芥8-9以及黄羽扇豆11等真核生物的 EF-G 基因已经被分离，但在棉花中关于延伸因子 EF-G 的研究尚未见报道。本课题组在陆地棉种子萌发相关性状的关联分析中鉴定到一个叶绿体延伸因子基因GhCEF-G0612，其在发芽较慢的新陆早 28 号中的相对表达量较高。为了明确 EF-G 在棉花基因组中的详细信息及功能，本文以陆地棉 农大棉8号为参考基因组，对陆地棉延伸因子 GhCEF-G 家族成员进行全基因组鉴定并对其基因结构、染色体分布、进化关系以及在种子萌发过程中的表达模式和功能开展了研究，以期为棉花种子萌发调控的分子机制提供新思路，并为棉花遗传性状改良等相关研究提供理论依据和基因资源。1 材料和方法1.1 试验材料植物材料为陆地棉品种新陆早 28 号和哥伦比亚野生型拟南芥 Col-0，由实验室前期收集保存；菌株为大肠杆菌 DH5、农杆菌 GV3101 购自天根生物公司；植物表达载体 pGreen 由本实验室保存。1.2 试验方法1.2.1陆地棉 GhCEF-G 基因家族成员的鉴定基于本实验室 3 代测序组装的农大棉 8 号基因组数据作为参考13，利用 EF-G 基因家族特有的保守 结 构 域（PF03764）从 Cott