鲁氏酵母高盐环境下的高密度发酵条件研究_刘慧平.pdf

2023 年 第 4 期 广 东 化 工 第 50 卷 总第 486 期 17 鲁氏酵母高盐环境下的高密度发酵条件研究鲁氏酵母高盐环境下的高密度发酵条件研究 刘慧平1,2*，伍晓伟1,3，邓毛程1,2，李静1,2，叶茂1,2(1广东轻工职业技术学院 食品与生物技术学院，广东 广州 510300；2广东省特色调味品工程技术开发中心，广东 广州 510300；3广东石油化工学院 生物与食品工程学院，广东 茂名 525000)摘 要鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)是一种广泛应用于酱油及酱类食品生产的耐高盐酵母。本研究采用单因素试验和正交试验对鲁氏酵母在高盐浓度下的高密度发酵培养基组成及培养条件进行优化。结果表明：鲁氏酵母的最优培养条件为：培养温度 28，初始 pH 值 5.5；最优培养基组合为葡萄糖 10%，酵母粉 2%，YNB 2%，NaCl 8%。在此优化条件下，鲁氏酵母的 OD600 nm值达到 30.7，比优化前显著提高。该研究为高密度发酵获得耐盐高活性鲁氏酵母奠定基础。关键词鲁氏酵母；高盐；高密度发酵；发酵条件 中图分类号TQ 文献标识码A 文章编号1007-1865(2023)04-0017-03 Study on High-Density Fermentation Conditions under High-Salt Environment of Zygosaccharomyces Rouxii Liu Huiping1,2*,Wu Xiaowei1,3,Deng Maocheng1,2,Li Jing1,2,Ye Mao1,2(1.College of Food and Biological Engineering,Guangdong Industry Technical College,Guangzhou 510300；2.Centre of Guangdong for Engineering and Technological Development of Specialty Condiments,Guangzhou 510300；3.College of Biology and Food Engineering,Guangdong University of Petrochemical Technology,Maoming 525000,China)Abstract:Zygosaccharomyces rouxii，as an improtant salt tolerant yeast,is widely applied in the production of soy sauce and other sauces.In this study,the culture composition and fermentation conditions for high-density fermentation under high-salt environment were optimized through single factor test and orthogonal test.The results showed that the optimum fermentation conditions for Zygosaccharomyces rouxii high-density fermentation were as follows:fermentation temperature 30,initial pH 5.5,the optimal medium composition were glucose 10%,yeast extract 2%,YNB 2%and NaCl 8%.Under these optimized conditions,the OD600 nm value of Zygosaccharomyces rouxii achieved to 30.7,which was significantly higher than that before optimization.Results presented in this study may contribute to obtain salt-tolerant and high-activity Zygosaccharomyces rouxii in high-density in industrial processes.Keywords:Zygosaccharomyces rouxii；high-salt；high-density fermentation；fermentation conditions 鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)是酱油及酱类食品酿造过程中重要的微生物之一，在高盐浓度下仍能较好生长1。以往的研究表明，鲁氏酵母可产生异戊醇、活性戊醇、异丁醇等多种杂醇类芳香风味物质，可以促进酱油及酱类食品特色风味的形成，提高发酵食品的品质，缩短发酵周期2-4。酱油及酱类食品发酵生产通常是在高盐环境下进行，有研究表明，一定浓度的 NaCl 有助于鲁氏酵母生产挥发性风味化合物(VFCs)，从而增加酱油风味5。然而，酱油及酱类食品酿造过程，尤其是高盐稀态酱油发酵的发酵醪盐浓度非常高，发酵醪的高盐环境使鲁氏酵母受到高盐渗透胁迫影响，同时，过酸以及发酵温度过高等多种环境因素胁迫，可导致鲁氏酵母因细胞结构和生理损伤发生自溶从而失去活性，从而影响酱油风味和质量6-7。同时，传统酱油及酱类食品发酵过程中，鲁氏酵母的主要来源是环境中菌体的自然落入，由于环境中的菌体落入发酵醪的过程极其难以控制，数量和质量参差不齐，酿造出来的酱油质量也会容易随之发生改变8-9。研究表明，在酱油发酵后期适时接种鲁氏酵母可有效增加酱油风味，提高酱油的品质，缩短发酵周期，提高企业效益10-13。但这种技术对投加菌体的耐高渗透压能力和菌体质量有较高的要求。为使添加的鲁氏酵母更容易适应酿造环境生成风味物质，有效控制酿造过程，应对鲁氏酵母进行高密度复壮培养，并使之保持耐高盐特性且活性高。工业化生产中，高密度培养关键在于使用低成本且合适的营养成分和发酵条件进行发酵产物生产14。本研究是在前期筛选分离获得的高耐盐鲁氏酵母基础上，通过单因素试验及正交试验对鲁氏酵母在高盐浓度下的高密度发酵培养基组成及发酵条件进行优化，为高密度发酵获得耐盐高活性鲁氏酵母奠定基础。1 材料与方法材料与方法 1.1 材料与试剂 鲁氏酵母 J33(Z.rouxii J33)：本实验从辣椒酱中筛选分离获得并保藏。YPD 培养基：2%葡萄糖，1%酵母粉，2%酵母学蛋白胨，115 灭菌 20 min。1.2 方法 1.2.1 菌体密度的测定 将发酵后的菌液稀释至合适的倍数，用紫外-可见分光光度计于 600 nm 波长下进行比色测定测出吸光度值(OD600 nm值)，实际值等于测量值乘以稀释倍数。1.2.2 鲁氏酵母种子液制备 将甘油保存的菌种接种到YPD斜面活化，从活化好的斜面接种一环至已灭菌的YPD液体培养基中，于28，200 r/min的摇床内培养 3648 h，作为种子液。1.2.3 鲁氏酵母高密度发酵最适条件探究 将种子液按 2%(V/V)的接种量接种至 NaCl 浓度为 12%、pH 为 6.0 的 YPD 培养基中，200 r/min 的摇床内培养 3648 h，依次考察发酵温度(26、28、30、32、35)、初始pH 值(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5)、NaCl 浓度(4%、8%、12%、16%和 20%)对菌体密度的影响。1.2.4 鲁氏酵母高密度发酵培养基碳源和氮源单因素试验 采用优化后的培养条件，依次用 2%葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖替代 YPD 培养基中的葡萄糖，从中选取最优碳源。筛选出最适碳源后，考察碳源添加量(2%，5%，8%，10%，12%，14%)对鲁氏酵母菌体密度的影响。采用优化后的培养条件，依次用 2%酵母粉、YNB(Yeast Nitrogen Base)、蛋白胨、硫酸铵和硝酸铵替代 YPD 培养基中的氮源，从中选取最优氮源。筛选出最适氮源后，考察氮源添加量(1%，2%，3%，4%)对鲁氏酵母菌体密度的影响。1.2.5 鲁氏酵母高密度发酵培养基优化正交试验 根据单因素试验结果，选择对菌体生长(菌体密度)影响较大的 4 个因素葡萄糖添加量(A)、酵母粉添加量(B)、YNB 酵母氮源(C)、NaCl 添加量(D)为考察因素，设计 L9(34)正交试验。收稿日期 2022-08-19 基金项目 广东省教育厅青年创新人才类项目(2019GKQNCX055)；广东轻工职业技术学院人才类项目(KYRC2018-017)；广东轻工职业技术学院自然科学项目(KJ2020-007)作者简介 刘慧平(1988-)，女，广东广州人，博士，讲师，主要研究方向为发酵与酶工程技术。*为通讯作者。广东化工2023年 第4期第50卷 总第486期由生长曲线图及OD600nm值作为参考指标，对其培养基成分优化。试验因素与水平见表1。表表1鲁氏酵母培养基配方优化正交试验因素与水平鲁氏酵母培养基配方优化正交试验因素与水平Tab.1Factors and levels of orthogonal experiment forZ.rouxii high-density fermentation medium optimization%水平因素A葡萄糖B酵母粉CYNB酵母氮源DNaCl浓度1122242103383844122结果与讨论结果与讨论2.1鲁氏酵母耐盐高密度发酵培养条件的优化从图1a可知，鲁氏酵母在28的菌体密度达到最高值。发酵温度低于26或高于32会抑制菌体的生长活力，OD600 nm值急剧降低，考虑是鲁氏酵母胞内酶在低温或高温时活性下降，代谢水平降低，从而影响菌体生长。因此，确定最佳发酵温度为28。从图1b可知，初始pH值在4.55.5范围内随着pH升高，鲁氏酵母的菌体密度不断提高，当初始pH值在5.5时鲁氏酵母的菌体密度达到最高值。当初始pH值提高到6.5时，菌体密度明显下降。因此，确定最佳初始pH值为5.5。图图1发酵温度发酵温度(a)及初始及初始pH值值(b)对鲁氏酵母生长的影响对鲁氏酵母生长的影响Fig.1Effect of temperature(a)and initial pH value(b)on the growth of Z.rouxii图图2NaCl浓度对鲁氏酵母菌体密度的影响浓度对鲁氏酵母菌体密度的影响Fig.2Effect of NaCl concentration on the growth of Z.rouxii鲁氏酵母在酱油及酱类食品酿造过程中不可避免地遇到高盐渗透胁迫。因此我们研究了在NaCl胁迫下的鲁氏酵母的生长情况(图2)。如图2可知，鲁氏酵母能在NaCl浓度低于12%的培养基中生长良好，在NaCl浓度到达8%时达到最大值，说明适量的NaCl有助于鲁氏酵母的生长。而且，有研究表明，一定浓度的NaCl有助于鲁氏酵母生产挥发性风味化合物(VFCs)，从而增加酱油风味5。然而，当NaCl浓度高于12%时，鲁氏酵母的菌体密度断崖式下降，说明过高浓度的盐会抑制鲁氏酵母的生长，尤其当盐浓度上升到20%时，鲁氏酵母的的生长基本停滞。现有的研究表明这可能是由于高盐胁迫下鲁氏酵母细胞壁发生破裂，糖代谢、氨基酸代谢、核糖体生物合成等受干扰，细胞结构和生理损伤使鲁氏酵母失去活性7。2.2碳源单因素试验结果碳源种类及其添加量对鲁氏酵母菌体生长的影响如图3所示。碳源对鲁氏酵母菌体生长的影响差异较大。由图3a可知，葡萄糖作为培养基碳源时鲁氏酵母的菌体密度最大。同时，菌体的对数生长期能到来得更早。说明鲁氏酵母对葡萄糖的利用效率最好。鲁氏酵母对不同碳源的利用率为：葡萄糖麦芽糖乳糖蔗糖，因此选择葡萄糖作为培养基的最适碳源。由