硫酸锌通过抑制活性氧促进L...导的小胶质细胞向M2型极化_王喆.pdf

基金项目：国家自然科学基金，项目编号：，；辽宁省“兴辽英才计划”创新领军人才项目，项目编号：。作者简介：王喆（），男，四川成都人，在读硕士研究生，主要研究方向为脊髓损伤发病机制。通讯作者：梅晰凡（），男，辽宁海城人，教授，博士学位，主要研究方向为脊髓损伤发病机制。硫酸锌通过抑制活性氧促进 诱导的小胶质细胞向 型极化王喆，徐唱，林森，梅晰凡（锦州医科大学研究生学院；锦州医科大学附属第三医院，辽宁 锦州）摘要：目的 探索硫酸锌是否通过抑制活性氧促进脂多糖（，）诱导的小胶质细胞向 型极化。方法 提取小鼠原代小胶质细胞，应用 （，二甲基噻唑），二苯基四氮唑溴盐（）比色法确定各药品的最适浓度；通过免疫印迹方法检测各组细胞中 和 蛋白表达差异；应用 技术检测各组细胞中白介素（，）和精氨酸酶 （，）的表达差异。结果 显著增加 蛋白和 的表达，诱导小胶质细胞向 型转化。硫酸锌减少 蛋白和 的表达，增加 蛋白和 的表达，促进 诱导的小胶质细胞向 型转化，但是此作用被 逆转。结论硫酸锌可通过抑制活性氧促进 诱导的 型小胶质细胞向 型极化。关键词：硫酸锌；小胶质细胞；极化；活性氧中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，；，）：，：；小胶质细胞是中枢神经系统中固有的免疫细胞，在大脑发育早期即出现，起源于卵黄囊中的造血干 细 胞，随 着 胚 胎 发 育 迁 移 到 脑 和 脊 髓 等处。小胶质细胞与巨噬细胞的功能和表型特征相似，在生理条件下具有免疫监视和宿主防御的功能，它可以吞噬坏死的神经元、变性的髓鞘，介导突触的可塑性。生理状态下，大多数的小胶质细胞处于静息状态，但是在中枢神经系统损伤或某些刺激下，小胶质细胞能够快速激活，增殖发育。小胶质细胞的活化与阿尔茨海默病、帕金森病、癫痫等神经炎症疾病关系密切，脑缺血和脊髓损伤等疾病的发生发展与小胶质细胞也有密切的关系。研究小胶质细胞的作用机制是目前神经科学领域的热点之一。疾病早期，激活的小胶质细胞能够吞噬坏死组织碎片，但同时也会释放大量炎症因子，影响神经元和其他胶质细胞的存活和功能。锦州医科大学学报 （）DOI:10.13847/ki.lnmu.2023.01.001激活后的小胶质细胞分化为 和 两种表型，型小胶质细胞分泌炎性因子，如一氧化氮合酶（，）、白细胞介素（，）、白细胞介素（）、肿瘤坏死因子（，）等，加重疾病；型小胶质细胞分泌抗炎因子，如白细胞介素（，）、白细胞介素（，）和转化生长因子 （，）等，促进损伤的修复。大量的研究证实，调控小胶质细胞的表型转化能够影响神经系统疾病的预后。如在大脑缺血 再灌注损伤的病程中，减少 型小胶质细胞可明显促进功能恢复。应用补肾益智抗衰方调控小胶质细胞和巨噬细胞的极化能显著改善 小鼠的认知功能。锌是维持机体正常生理活动必不可少的微量元素之一，可结合多种蛋白质，催化多种酶类，对机体的生长发育以及物质代谢和免疫功能均有重要作用。锌稳态的失调与多种神经系统疾病关系密切。越来越多的证据表明，锌缺乏与认知功能减弱、抑郁症、阿尔茨海默病以及脊髓损伤等有一定的关系。文献报道，锌离子具有抗氧化和抗炎的作用，可影响巨噬细胞的极化。本课题组的前期实验也证实，锌离子能改善脊髓损伤动物的神经运动功能，抑制损伤组织的炎症反应，减轻氧化应激，减少神经元凋亡。锌离子可影响小胶质细胞的功能，但是具体的作用机制还有待深入探索。在这项研究中，我们应用分子生物学技术探究硫酸锌对体外培养的原代小胶质细胞 型和 型标记物的影响，明确锌对小胶质细胞极化的调控作用，而且，我们还探索了氧化应激在锌调控小胶质细胞极化过程中的作用，揭示锌调控小胶质细胞极化的作用机制。材料和方法 实验材料 日龄 小鼠，体重（），由北京维通利华公司提供。硫酸锌购自 公司，脂多糖（）购自北京索莱宝公司，（，二甲基噻唑 ），二苯基四氮唑溴盐（）购自北京索莱宝公司。兔抗小鼠 多克隆抗体、兔抗小鼠 多克隆抗体购自英国 公司，小鼠抗 单克隆抗体购自美国 公司，培养基购自 公司，胎牛血清购自 公司，蛋白试剂盒购自英国 公司，膜购自 公司，发光液购自碧云天生物技术公司，试剂购自美国 公司，实验涉及的引物由大连吉玛生物工程公司合成。凝胶成像电泳系统购自美国 公司，仪购自美国 公司。实验方法 原代小胶质细胞提取及培养所有实验方案都获得了锦州医科大学实验动物委员会的批准，并按照相关指导方针执行。原代小胶质细胞利用 日龄的 小鼠获得，使用吸入性麻醉剂异氟烷麻醉小鼠，取材小鼠脊髓组织。具体步骤如下：（）液清洗 次；（）再切碎后置于含 浓度的胰蛋白酶 液中，并放置于 下消化 ；（）以 转速离心 ；（）加入培养基，并置于培养瓶中培养 ，隔天更换培养基；（）后，显微镜下观察小胶质细胞形态并拍照；（）将培养瓶在 下，以 的速度摇晃 ；（）收集悬浮的细胞，并将细胞接种在密度为 细胞 孔的 孔平板或 细胞 孔的 孔平板中；（）在 下，放置于 培养箱中进行培养。法检测细胞活性通过 比色法确定脂多糖（）、硫酸锌（，）以及过氧化氢（）的最佳处理浓度。将原代小胶质细胞以 细胞 孔的密度接种到 孔板中，分别加入 个梯度浓度的、和，每孔加液体 ，设复孔 个，培养 。每孔中加入 溶液（），继续孵育 。吸掉液体，每孔加入 二甲基亚砜，摇床低速震荡 溶解结晶，在酶联免疫检测仪 处测量吸光度值，记录数值，统计分析。实验分组、细胞处理及样品收集待原代小胶质细胞进入对数生长期后，将其分为 组进行实验：（）正常对照组；（）组；（）组；（）组。组和 组在应用 刺激细胞 后充分洗涤，加入 ，组在加入 的同时加入 ，继续培养 。各组细胞弃掉培养基，冷 清洗 次，刮取细胞，细胞悬浊液每 离心 ，弃上清液，收集样品，冻存备用。免疫印迹（）法测定 和王喆，等：硫酸锌通过抑制活性氧促进 诱导的小胶质细胞向 型极化 蛋白表达取冻存的细胞，加入 裂解液，摇床裂解，以 的速度离心，吸取上清液。应用 法测定蛋白浓度，配置最终蛋白含量为 的样品。配置 聚丙烯酰胺凝胶，分离胶，浓缩胶。在聚丙烯酰胺凝胶中加入样品和，电压起始电泳，待样品到达分离胶时加压到 ，样品经电泳分离后，“三明治”法湿转至 膜上，转膜时间。清洗 ，次。脱脂奶粉室温下封闭 ，加入一抗（，；，），孵育过夜。次日，洗膜 次（分钟 次）后，加入二抗（）室温孵育 ，清洗 次（分钟 次）。法发光，凝胶成像系统成像。应用 软件分析各目标蛋白条带的灰度值，以 为内参。定量实时聚合酶链反应（）用 试剂从小胶质细胞中提取总，用 总 合成。采用 进行，在 个快速 系统上，扩增 ，在 个 循环 和 循环 之后，将靶基因的相对表达水平与核糖体蛋白 （）的相对表达水平进行标准化，并用（）法将实验组的靶基因与对照组的相应靶基因进行对比。引物如下：和；：和 ；：和。统计学方法采用 软件进行统计学分析，实验数据用均数标准差表示。采用 检验和单因素方差分析法对两组及两组以上的数据进行分析，以 为差异具有统计学意义。结 果 、以及 的最佳浓度测定结果我们培养的原代小胶质细胞在静息状态为短小杆状或细长梭形，可见突起，见图。为了确定、以及 的最佳浓度，我们应用 法检测细胞活力。的浓度梯度为：、；的浓度梯度为：、；的浓度梯度为：、。检测结果显示：与对照组比较，浓度，浓度、浓度，细胞活力无明显变化。而当、以及 浓度在 内分别增加到、和 时，细胞活力降低明显，差异具有统计学意义，见图。因此，在后续实验中，我们选择应用 的、的 和 的 孵育细胞 。：原代小胶质细胞形态；：给药浓度 结果；：给药浓度 结果；：给药浓度 结果；：与对照组比较，图 法确定各处理因素最佳浓度 硫酸锌促进由 激活的 型小胶质细胞向 型极化原代小胶质细胞经 刺激后，细胞形态发生改变，细胞释放大量炎性因子，分化为 和 两种表型。是 型小胶质细胞的标记物，是 型小胶质细胞的标记物。为了评价硫酸锌对 诱导的小胶质细胞极化的影响，我们用 方法以及 技术检测、蛋白和 的表达。结果显示：与对照组相比，组 蛋白的表达增高，但 的处理并不影响小胶质细胞 蛋白的表达水平；与 组相比，硫酸锌组 蛋白的表达明显降低，蛋白表达显著增加，见图。结果与 实验结果一致，能够增加 表达，但是不影响 表达，给予硫酸锌处理后，与 组锦州医科大学学报 年 月，（）比较，表达明显减少，的表达显著增加，见图。：免疫印迹条带；：蛋白表达半定量统计分析；：蛋白表达半定量统计分析；：与对照组比较，；：与 组比较，；：与 组比较，图 免疫印迹检测法检测各组小胶质细胞 和 蛋白表达：与对照组比较，；：与 组比较，；：与 组比较，图 各组细胞 和 表达 检测结果 外源性 逆转硫酸锌对 诱导的小胶质细胞极化的影响活性氧（，）介导的氧化损伤显著影响小胶质细胞的功能。不仅是一种，而且是研究氧化应激的重要工具。因此，本实验增设了 干预组，该组细胞在 刺激后加入 的 和 的。免疫印迹结果显示：与加锌组相比，组 蛋白表达升高（），蛋白表达降低（）。检测结果与免疫印迹结果一致，组 增加，减少。这表明硫酸锌促进 激活的小胶质细胞向 型转化，但是 减弱锌的这种作用，锌调控小胶质细胞极化与氧化应激有一定的关系。讨 论小胶质细胞是中枢神经系统中固有的免疫细胞，是多方面调节神经炎症的关键细胞。在正常生理状态下，静息的小胶质细胞胞体较小，有多个分支，吞噬能力较强，可吞噬凋亡的细胞和神经的毒性蛋白。疾病状态下或者中枢神经系统遭遇创伤后，小胶质细胞迅速激活，体积增大，突起回缩，释放炎性介质。激活的小胶质细胞有两种表型：经典激活型（型）和选择性激活型（型）。损伤急性期，型小胶质细胞持续活化，过度分泌、等炎症因子和神经毒性分子，对机体造成继发性损害。型小胶质细胞分泌、和 等抗炎因子，具有神经保护作用。近年来的研究证实，抑制 型小胶质细胞激活，促进 型小胶质细胞激活或者诱导小胶质细胞从 型极化为 型，王喆，等：硫酸锌通过抑制活性氧促进 诱导的小胶质细胞向 型极化对神经系统疾病具有明显的治疗效果。学者们应用药物疗法和物理疗法等多种手段调控小胶质细胞的极化，在神经病理性疼痛等疾病治疗方面取得了一定的突破。如应用利拉鲁肽调控小胶质细胞极化改善糖尿病大鼠脑缺血损伤；应用右美托咪定抑制 核易位调控小胶质细胞极化，减轻大鼠创伤性脑损伤神经炎症；应用自主跑轮运动，通过调控海马小胶质细胞极化，改善慢性应激诱导的大鼠抑郁样行为。本课题组在前期实验中也证实，调控小胶质细胞和巨噬细胞的极化能促进脊髓损伤小鼠神经功能的恢复。锌是人体必需的微量元素之一，几乎参与机体内所有的生理代谢过程，发育、免疫功能以及内分泌的调节等都离不开锌离子的调控。锌是多种酶类和转录蛋白的主要组成部分，在基因稳定性和基因表达等方面均有重要的作用。除此之外，锌还具有抗炎和抗氧化等作用。文献报道，锌可通过抗氧化作用缓解多种器官损伤，如骨骼肌和睾丸的缺血再灌注损伤。在大脑和脊髓等神经组织中，锌离子含量丰富，储存在神经元突触囊泡中，随着神经组织的活动，锌离子从神经元轴突末梢的突触小泡中释放，进入突触间隙，与突触后膜上的受体结合，调控突触后细胞的功能活动。锌离子缺乏或者锌离子稳态的失衡会导致痴呆、帕金森等疾病，中枢神经系统的创伤性疾病也与锌离子关系密切，补锌可保护创伤性脑损伤。本课题组的前期研究也发现：外源性锌的补充能增加小胶质细胞的活性，继而促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复，但具体的分子机制有待深入探索。由于目前常用的 细胞系不能全面的反映小胶质细胞的特性，本研究在参考文献和前期实验的基础上提取培养原代小胶质细胞，结果证实：我们提取的原代小胶质细胞符合小胶质细胞的形态特点，从幼鼠脊髓组织提取小胶质细胞是可行的。是革兰氏阴性细菌的细胞壁成分，可诱导炎症反应。本实验应用 的 刺激原代小胶质细胞，炎症因子 的表达显著增加，证明 型细胞模型诱导成功。本研究使用 的锌进行实验，该浓度的锌无细胞毒性，给予 硫酸锌处理后，小胶质细胞的炎症因子 表达减弱，抑炎因子 表达增加，这表明外源性的锌可诱导 型小胶质细胞向 型极化。大量的研究表明活性氧（）介导的氧化损伤在多种疾病的病理过程