巨大芽胞杆菌YB-3的筛选...对生姜青枯病的生防效果研究_汪茜.pdf

39(1)204-211 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2023 年 2 月 收稿日期：2022-01-26 基金项目：广西重点研发计划（桂科 AB21238002）；广西科技基地和人才专项（桂科 AD20159001）；广西农业科学院基本科研业务专项（桂农科 2022JM59）作者简介：汪茜，硕士，副研究员，E-mail：；*通信作者，陈廷速，博士，研究员，E-mail：；周生茂，博士，副研究员，E-mail：。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2023.02.004 巨大芽胞杆菌YB-3的筛选、鉴定及其对生姜青枯病 的生防效果研究 汪 茜1，宋 娟1，李冬萍1，覃晓娟2，陈廷速1*，周生茂3*（1.广西农业科学院微生物研究所，南宁 530007；2.广西农业科学院，南宁 530007；3.广西农业科学院蔬菜研究所，南宁 530007）摘要：青枯病（bacterial wilt）是生姜上的一种细菌土传毁灭性病害，化学防治易污染环境且常规化学药剂很难在土壤中起到持续控病的作用，生物防治是其理想的防治方法。为开发对生姜青枯病有效的生防措施，对从生姜根际土壤中分离的一株生防细菌 YB-3 进行了鉴定，并对其生物学特性及生防效果进行了研究，以丰富生防菌株资源库。采用抑菌圈法筛选拮抗细菌，对效果最好的拮抗菌株做盆栽试验，测定其对生姜青枯病的防治效果，根据形态特征、生理生化特性以及 16S rDNA 序列对筛选得到的优良菌株进行鉴定。试验结果表明，该拮抗菌在平皿上对青枯菌的抑菌率为 50.67%，盆栽试验对青枯病的防治效果为 60.86%；经 16S rDNA 序列分析，并结合形态学和生理生化特征，将菌株 YB-3 鉴定为巨大芽胞杆菌 Bacillus megaterium。YB-3 是一株具有开发利用价值的姜青枯病生防菌株。关 键 词：生姜青枯病；生防细菌；生物防治；巨大芽胞杆菌 中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2023)01-0204-08 Screening,Identification and Control Efficacy of Bacillus megaterium with Antagonist Activity against Ginger Wilt WANG Qian1,SONG Juan1,LI Dongping1,QIN Xiaojuan2,CHEN Tingsu1*,ZHOU Shengmao3*(1.Microbiology Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China;2.Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China;3.Vegetable Research Institute of Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China)Abstract:Bacterial wilt of ginger,referred to as“ginger blast”caused by Ralstonia solanacearum,is the destructive pathogen of ginger reported from all the ginger growing countries.But there is no means available for effective control of the disease in field.Obtaining effective strains with disease control activity is an urgent prerequisite for biological control efficiency.This study was performed to explore if the plant growth-promoting rhizobacteria(PGPR)in ginger plants had any potential to induce resistance to Ralstonia solanacearum.Three strains were selected for evaluation of ginger growth promotion ability and control efficacy against the ginger wilt through culture dish and pot culture method,and the dominant strain YB-3 was identified based on its 16S rDNA sequence homology with the related bacteria from GenBank as well as physiological and biochemical characters.The results showed that the control effect of strain YB-3 was 60.86%in pot experiment.The strain YB-3 was identified as Bacillus megaterium by morphological observations,physiological and biochemical tests,combined with 16S rDNA analysis.These results indicated that the strain YB-3 had the exploitation value 第 1 期 汪茜等：巨大芽胞杆菌 YB-3 的筛选、鉴定及其对生姜青枯病的生防效果研究 205 against ginger wilt disease.Key words:ginger wilt;biocontrol bacteria;biocontrol effect;Bacillus megaterium 生姜 Zingiber officinale Rosc.是中国以及印度、尼泊尔、印度尼西亚、尼日利亚等几个国家栽培的最重要的香料作物之一1。生姜生长过程中受许多病虫害的危害，如软腐病、细菌性枯萎病、黄姜病、叶斑病和贮藏腐烂，在众多病害中，由青枯劳尔氏菌 Ralstonia solanacearum 引起的青枯病是最具毁灭性的病害，一般病田发病率为 10%30%，重症田高达 90%以上，甚至全田枯死，种姜全部腐烂2，经济损失巨大，严重制约了生姜产业的持续健康发展。目前，防治生姜青枯病主要还是施用化学杀菌剂、种植抗病品种和作物轮作等策略。迄今为止，化学农药施用仍然是最常见的控制策略。然而，化学农药造成农药残留、污染环境和使病原菌产生抗药性等问题日益严重3,4。近年来，随着人们对食品安全和环境污染的担忧，消费者对无农药食品的要求越来越高，一些化学杀菌剂的使用在许多发达国家和地区受到了严重的限制。利用有益微生物减少或替代农药和化肥的使用，对于维持植物微生态系统的生物多样性具有重要意义，因此，生物防治引起了众多研究者的极大兴趣5,6。开展生物防治工作的重要基础是分离获取具有生防潜能的微生物，近年来已有不同种类的生防菌用来防治青枯病。Zhang 等7从生姜根际土壤中分离得到 3 株固氮菌，并对其抑菌活性进行初步筛选和体外拮抗青枯菌活性评价。结果发现接种 N10 和 SJN5 的生防效果最好，分别降低病害发生率 39.98%和45.61%，被鉴定为泛菌属 Pantoea sp.和节杆菌属 Arthrobacter sp.。赵志祥等8从生姜青枯病发病较重的田块采集 17 份健康生姜根际根围土样，采用稀释平板分离和室内拮抗活性测定，筛选出 1 株拮抗细菌菌株对生姜青枯病菌具有较强拮抗活性，并鉴定为枯草芽胞杆菌 Bacillus subtilis。刘勇等9测定了枯草芽胞杆菌 Bs2004 对生姜青枯病的防病促生作用，结果表明该菌能降低由青枯病引起的死亡率 11.5%，并使姜苗鲜重增加 52.5%，使生姜增产 51.2%。Zhou 等10从山东莱芜生姜块茎中分离得到 41 株内生菌株，其中芽胞杆菌 10 株，分离的内生芽胞杆菌大多对青枯菌表现出拮抗活性。其中有 2 株的拮抗活性最高，鉴定为蜡样芽胞杆菌 Bacillus cereus 和枯草芽胞杆菌 Bacillus subtilis。目前利用拮抗菌来防治生姜青枯病的研究还大多处于室内筛选阶段，由于生防菌剂的田间防治效果受环境条件、施用方法和生防菌自身定殖繁殖等因素的影响，能在田间应用还比较少，本研究从生姜根际土壤中分离筛选出 1 株对青枯菌具有明显较强拮抗作用的生防细菌，通过形态学、生理生化测试及 16S rDNA 对其进行鉴定，并进行了离体条件下的防效试验研究，以期为生姜青枯病提供新的微生物资源，也为下一步生姜青枯病的田间防治奠定理论基础和技术支撑。1 材料与方法 1.1 试验材料 NA 培养基：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，氯化钠 5 g，琼脂粉 17 g，水 1 L，pH 7.2，用来分离纯化、鉴定拮抗菌；LB 培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，氯化钠 10 g，水 1 L，pH 7.011，用来制备拮抗菌发酵液。供试生姜青枯病病原菌为青枯劳尔氏菌（菌株 Gg06），由广西大学农学院袁高庆老师惠赠。供试生姜苗为组培苗，由广西农业科学院微生物研究所土壤微生物团队提供，选取长势一致且健康无病的组培苗用来做盆栽试验。1.2 生姜青枯病拮抗细菌的分离筛选 1.2.1 土样细菌的分离 从广西生姜主产区柳江、来宾、百色等地采集生姜根际部位土壤（表层土下 510 cm），土壤过筛后称取 1 g 溶解于装有 99 mL 无菌水的三角瓶中（三角瓶底部放入灭过菌的玻璃珠），置于摇床 120 r/min 振荡 20 min 后静止使澄清。用移液枪吸取上清液 1 mL 加入 9 mL 无菌水中，用无菌水依次稀释成 10-110-6的浓度，然后取 10-4，10-5和 10-6的稀释浓度，用移液枪吸取 100 L 涂布于 NA 平板上，待平板表面干燥后倒置于 30 恒温培养箱中培养 23 d，挑取细菌单菌落进行纯化培养12。1.2.2 拮抗菌的初筛 将培养好的病原菌液稀释后涂布于 NA 平板上，待表面干燥后在培养皿四周用接种环 206 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 点上分离得到的细菌菌液，接种完之后放置于 30 恒温箱中培养 2 d 后观察结果，选取抑菌带宽度在 3 mm以上的菌株进行复筛。1.2.3 拮抗菌的复筛 将拮抗菌和病原菌各自转接于 LB 培养基中，30、180 r/min 振荡培养 24 h 后用无菌水将菌液浓度调至 1108 CFU/mL 备用。在培养皿上倒入薄薄的一层水琼脂，将灭菌的牛津杯放置于培养皿中央，青枯菌菌液按 1%的接种量加入冷却至 45 的 NA 培养基中，迅速轻轻振荡混匀（防止用力过大产生气泡），倒入琼脂平板上，待培养基凝固后用灭菌的镊子取出牛津杯，之后加入100 L无菌发酵滤液（拮抗菌液5000 r/min 离心 3 min取上清液，用 0.22m 细菌过滤器过滤其上清液，即得无菌发酵滤液），以不加无菌滤液的带菌平板为对照，每个处理重复 3 次，在 30 恒温箱中培养 2 d 后用十字交叉法测量抑菌圈直径，并计算抑菌率12。抑菌率（%）（处理抑菌圈直径对照抑菌圈直径）/处理抑菌圈直径100。1.3 生姜青枯病盆栽防治效果测定 温室试验中，测定菌株 YB-3 对生姜青枯病的防效