巨噬细胞MED1缺失促进雌...R敲除小鼠动脉粥样硬化发展_温尔刚.pdf

第 卷第期 年月西 安 交 通 大 学 学 报（医 学 版）（）本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版基础研究巨噬细胞 缺失促进雌性 和 敲除小鼠动脉粥样硬化发展温尔刚，高杰，丁怡铭，鲍妙叶，张元鹍，张亚莉，赵四海，刘恩岐，白亮，（西安交通大学医学部基础医学院实验动物学系，陕西西安 ；西安交通大学医学部转化研究院心血管研究所，陕西西安 ）摘要：目的研究巨噬细胞 （）缺失对雌性小鼠动 脉 粥 样 硬 化 的 影 响。方 法利用 敲除（）、敲除（）、和巨噬细胞 敲除（）小鼠，分别构建两种模型小鼠：和巨噬细胞 双敲除（）及 对照小鼠；接受 小鼠骨髓移植的 （）和接受 小鼠骨髓移植的 （）对照小鼠。给予两种模型小鼠（雌性）饲喂西方饮食 周诱导动脉粥样硬化发生，动态测定小鼠体质量及血浆总胆固醇（）、总三酰甘油（）含量。饲喂 周后处死小鼠，对主动脉树和主动脉根部进行和油红染色，并计算斑块面积。结果与 对照组小鼠相比，实验组小鼠血浆 和 无明显差异，但其主动脉树和主动脉根部斑块面积显著增加。而且，与 对照组小鼠相比，实验组小鼠的主动脉树和主动脉根部斑块面积也有增加趋势。结论巨噬细胞 缺失促进雌性小鼠动脉粥样硬化发展。关键词：巨噬细胞；动脉粥样硬化；基因敲除；雌性小鼠中图分类号：文献标志码：，（，；，）：（）（），（），（）：（）（）（）（）（）（），（），（），（）收稿日期：修回日期：基金项目：国家自然科学基金（）、中国博士后科学基金（，）和陕西省创新能力支撑计划项目（）资助 （），（，），（）通信作者：白亮 ：网络出版时间：网络出版地址：西 安 交 通 大 学 学 报（医 学 版）第 卷本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版 ，：；心血管疾病是严重危害人类健康和生命的“头号杀手”，具有高发病率、致残率和致死率等特点。流行病学资料显示，全世界每年约有 万人死于心血管疾病，预计到 年将超过 万。动脉粥样硬化是众多心血管疾病的共同病理基础，其发病是由多个遗传和环境因素相互作用所致，确切病因至今尚未明确。研究认为，动脉粥样硬化发生最为关键的触发因素是富含载脂蛋白的某些脂蛋白侵入动脉壁，诱导血液中单核细胞与血管内皮细胞黏附；单核细胞迁入内膜分化为巨噬细胞，并吞噬脂质形成泡沫细胞，进而融合堆积形成粥样斑块，引发一系列的血管炎症反应。作为动脉粥样硬化血管病变部位的主要免疫细胞，巨噬细胞表达与脂类摄取和胆固醇流出相关的基因受一系列核受体及转录辅激活因子的调控。比如，巨噬细胞的核受体辅抑制子（）通过抑制小鼠和人的 靶基因而抑制动脉粥样硬化的发展。巨噬细胞中的核因子 通过上调 而降低 和 水平，进而阻止泡沫细胞形成及动脉粥样硬化。是一种非常重要的转录辅激活子，其通过两个 基序与许多核受体如 、和 等以配体依赖性方式结合。通过调控相关基因的表达，参与脂质代谢、能量调控及癌症等病理生理学过程。肝脏 特异性敲除（）小鼠能够抵抗高脂饮食和 诱导的脂肪肝形成，且下 游 信 号 通 路 的 和 等 基 因 表 达 下调。心肌 敲除小鼠的心脏表现出心室扩张、射血分数降低和线粒体损伤，并导致代谢和线粒体相关基因表达失调。在乳腺癌组织中 出现高表达，表明 在核受体 信号通路中也发挥着关键的调控作用。本 课 题 组 前 期 以 巨 噬 细 胞 敲 除（）的雄性小鼠为研究对象，发现 通过核受体 调控巨噬细胞极化，抑制动脉粥样硬化的发生和发展。然而，巨噬细胞 在雌性小鼠动脉粥样硬化发生过程中的作用尚不清楚。鉴于 在雌激素受体信号通路中发挥重要调控作用，本研究用巨噬细胞 与 双敲除雌性 小 鼠 模 型（），以 及 接 受 小鼠骨髓移植的 （）雌性小鼠模型，研究巨噬细胞 缺失对雌性小鼠动脉粥样硬化形成的影响。材料与方法实验动物含有 两 个 位 点 的 和 巨 噬 细 胞 敲除（）小鼠来自西安交通大学医学部实验动物中心。小鼠和 小鼠购买自美国 实验室。普通饮食和西方饮食饲料（含有 脂肪，胆固醇）由西安交通大学医学部实验动物中心提供。所用实验动物均在西安交通大学医学部实验动物中心的无特定病原菌（，）屏障设施内饲养，小鼠自由饮水，光照和 黑暗交替，环境温度为（）。所有动物实验均经过西安交通大学医学部伦理委员会批准实施，实验过程遵循国家实验动物管理的相关法律和规定。小鼠模型的构建及基因型鉴定将 小鼠与 小鼠进行交配，获得 杂 合 小 鼠，此 小 鼠 再 与 小鼠杂交，筛选获得 小鼠。此后，用 小鼠和 小鼠进行杂交，经基因型鉴定筛选获得双基因敲除 小鼠模型。用蛋白酶法提取小鼠尾部基因组 进行 扩增后，用琼脂糖凝胶电泳检测目的基因片段。骨髓移植实验提取雌性 小鼠和其同窝对照 小鼠股骨和胫骨中的骨髓。给周龄雌性 小鼠照射 的铯射线，然后将 的 或 小鼠骨髓细胞通过尾静脉注射入其体内。骨髓细胞移植后，用普通饮食饲养周，再给予西方饮食饲喂 周。期温尔刚，高杰，丁怡铭，等 巨噬细胞 缺失促进雌性 和 敲除小鼠动脉粥样硬化发展本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版血脂生化检测 及 对照小鼠、及 对照小鼠禁食后，用含有肝素的毛细血管进行尾尖采血。使用中生北控生物科技股份有限公司的试剂盒检测血浆总胆固醇（，）和总三酰甘油（，）水平。动脉粥样硬化斑块面积的观察 及 对照小鼠、及 对照小鼠经西方饮食喂养 周，用异氟烷安乐处死小鼠，取出整个主动脉树以及心脏，将主动脉纵向切开，进行油红 染色，拍照，使用 软件评估斑块面积。用 包埋主动脉根部，连续切片（厚），分别进行和油红染色，封片、拍照，使用 软件评估斑块面积。统计学分析实验数据用平均值标准误表示，采用 软件处理分析。两组间比较采用 检验，表示差异有统计学意义。结果成功繁育 小鼠模型将 小鼠与 小鼠进行交配，构建 和巨噬细胞 双敲除的 小鼠模型。基因型鉴定结果显示，电泳条带只含有 片段提示小鼠的两条同源染色体上均携带个 位点，即 小鼠；同时含有 片段和 片段，提示 小鼠且 为阳性，即 小鼠；含有 片段，表示 基因被敲除，即 小鼠（图）。：基因型鉴定结果；：基因型鉴定结果；：基因型鉴定结果。、号泳道为 小鼠；、号泳道为 小鼠。图 和 小鼠基因型鉴定凝胶电泳图 巨噬细胞 缺失促进 雌性小鼠动脉粥样硬化发生 小鼠的血浆 和 水平分析实验组（）和对照组（）小鼠饲喂 周西方饮食，体质量均无差异（图 和）；两组小鼠血浆的 和 水平无明显差异（图 和），表明巨噬细胞 缺失不影响 小鼠血脂水平。小鼠动脉粥样硬化斑块的染色结 果实 验 组（）和 对 照 组（）小鼠饲喂西方饮食 周，主动脉树油红 染色结果表明：与对照组相比，实验组小鼠的主动脉斑块面积显著增加（）（）；对照组，实验组；（图）；主动脉根部 和油红 染色显示：与对照组相比，小鼠的主动脉根部斑块面积增加（）.（），对照组，实验组；（图）。西 安 交 通 大 学 学 报（医 学 版）第 卷本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版：和 对照小鼠造模实验过程图；：两组小鼠体质量变化；：两组小鼠血浆 水平比较；：两组小鼠血浆 水平比较。与 组比较，。图巨噬细胞 缺失对 小鼠体质量及血脂影响 ：主动脉树油红染色及统计分析；：主动脉根部油红染色及统计分析。与 组比较，。图 小鼠主动脉树和主动脉根部油红染色及斑块分析 巨噬细胞 缺失对 雌性小鼠动脉粥样硬化发生的影响 小鼠的血浆 和 水平变化为进一步研究巨噬细胞 缺失对雌性小鼠动脉粥样硬化形成的影响，用 小鼠模型进行了骨髓移植实验。小鼠基因型电泳鉴定结果显示只含有 片段，提示小鼠的两条同源染色体上的 基因被敲除，即 小鼠；同时含有 片段和 片段提示为 小鼠；只含有 片段提示 小鼠（图）。分别将 或 小鼠骨髓移植到辐照后的 雌性小鼠，移植后周，再用西方饮食饲喂 周以诱导动脉粥样硬化发生，结果显示，实验组（）小鼠和对照组（）小鼠的体质量及血浆 和 水平均无明显差异（图 ），表明巨噬细胞 缺失不影响 小鼠血脂水平。小鼠动脉粥样硬化斑块面积染色结果西方饮食饲喂 周的主动脉树油红 染 色 结 果 表 明：与 对 照 组（）小鼠相比，实验组（）小鼠 主 动 脉 树 斑 块 面 积 有 增 加 趋 势 （）.（）；图 。而且，主动脉根部 和油红 染色结果也显示：实验组小鼠的斑块面积有增加趋势（）.（），对照组，实验组；图 。讨论动脉粥样硬化是引起众多心血管疾病的主要原因，会导致冠心病、心力衰竭、脑卒中等重大疾病。动脉粥样硬化斑块破裂是冠状动脉血栓形成的主要原因。扩大的坏死核心、薄纤维帽、病灶部位新生血管生成、斑块钙化等因素均易导致斑块破裂。斑块面积是衡量动物模型中动脉粥样硬化程度的重要指标。性别是心血管系统生理、病理和疾病发展的重要期温尔刚，高杰，丁怡铭，等 巨噬细胞 缺失促进雌性 和 敲除小鼠动脉粥样硬化发展本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版：基因型凝胶电泳鉴定图。其中、号泳道为 小鼠，、号泳道为 小鼠，、号泳道为 小鼠；：和 对照小鼠造模实验过程图；：两组小鼠体质量变化；：两组血浆 水平比较；：两组血浆 水平比较。图巨噬细胞 缺失对 小鼠体质量及血脂影响 ：主动脉树油红染色及统计分析；：主动脉根部油红染色及统计分析。图 小鼠主动脉树和主动脉根部油红 染色及斑块分析 影响因素。据统计男性冠心病的发病率为，而女性为。多个研究表明，性别也同样会影响动脉粥样硬化的发病率和并发症的发生，男性的总体斑块水平和炎症指标高于女性。本课题组前期研究已表明，巨噬细胞 缺失可导致雄性小鼠动脉粥样硬化斑块面积增加，但尚无有关雌性小鼠 缺 失 对 动 脉 粥 样 斑 块 影 响 的 报 道。鉴 于 在雌激素受体介导的基因表达调控中也发挥重要作用，而雌激素对心脑血管疾病具有一定的保护作用。因此，本研究使用 和 两种小鼠模型观察巨噬细胞 缺失对雌性小鼠动脉粥样发生发展的影响。通过动脉粥样硬化斑块面积分析，发现巨噬细胞 缺失导致雌性小鼠的斑块面积增加。大量研究表明，动脉粥样硬化的发病机制与血脂异常和炎症密切有关。和 是衡量血脂水平的重要指标，血脂尤其是血浆胆固醇水平升高可促进动脉粥样硬化的发生发展。为探讨巨噬细胞 缺失促进雌性小鼠动脉粥样发生的具体机制，本研究分析了 和 对照小鼠、和 对照小鼠的血脂水平。结果发现，巨噬细胞 缺失对 或 雌性小鼠的血浆 和 水平均无明显影响，说明巨噬细胞 缺失并未通过影响血脂水平而促进动脉粥样硬化的发展。研究发现，巨噬细胞在动脉粥样硬化的发生和发展中起关键作用。巨噬细胞与脂蛋白结合形成泡沫细胞，并引发炎症联级反应，增强白细胞的招募，进西 安 交 通 大 学 学 报（医 学 版）第 卷本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版一步加剧动脉粥样硬化的发展。巨噬细胞分为 型和 型。型巨噬细胞可分泌大量促炎因子，如 、和 等，促 进 炎 症 反 应。型巨噬细胞可分泌一系列抗炎因子，如 、和 等，介导炎症消退，促进组织修复。一般情况下 型巨噬细胞产生的促炎因子会促进动脉粥样硬化的发展；型巨噬细胞有助于斑块消退。研究报道，巨噬细胞 缺失会增加活性氧的积累，从而激活巨噬细胞促炎信号通路。转录因子 通过激活 诱导巨噬细胞 型极化，从而抑 制 动 脉 粥 样 硬 化 的 发展。因此，以后可进一步研究 缺失对巨噬细胞表型转化、炎症通路以及炎症因子的调控，已明确 调控动脉粥样硬化发生发展的分子机制。参考文献：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：（编辑国荣）