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509癌 症 2 0 2 2年 第 4 1 卷 第 1 1期*通讯作者：赵允，；林谋斌，；何璐薇，1 同济大学医学院附属杨浦医院，临床研究与转化医学中心，上海 200090，中国；2 同济大学医学院，胃肠外科与转化医学研究所，上海 200090，中国；3 中国科学院大学，上海生物化学与细胞生物译作已获得版权所有者许可角鲨烯环氧酶通过积累骨化三醇和激活CYP24A1介导的MAPK信号通路促进结直肠癌细胞增殖何璐薇1,2,*，李华光1,2，潘晨宇1,2，华雨桐1,2，彭甲银3，周兆才4，赵允3,5,*，林谋斌1,2,6,*原创论著【摘要】背景与目的 结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是一种高发的恶性肿瘤，其分子机制和靶向治疗有待进一步研究。代谢紊乱是癌症的重要特征。靶向调节肿瘤代谢途径已成为现代肿瘤治疗的重要方向。在本研究中，我们旨在研究一种新的促进CRC增殖的代谢酶及相关的分子机制。方法 我们对人CRC组织样本进行了RNA测序和组织微阵列分析，来筛选CRC相关的新基因。角鲨烯环氧酶（squalene monooxygenase，SQLE）在CRC患者组织中高表达。通过检测CRC细胞的细胞活力、集落和类器官形成、细胞内胆固醇浓度和异种移植肿瘤生长，来明确SQLE在CRC进展过程中的调节功能和SQLE抑制剂的治疗效果。通过转录组和非靶向代谢组学联合分析，探讨SQLE发挥功能的分子机制。应用蛋白质免疫印迹和实时荧光定量PCR评估SQLE对MAPK信号通路的激活。结果 在CRC患者中SQLE相关的胆固醇生物合成被上调，并且与预后不良相关。SQLE在体外和体内促进CRC生长。抑制SQLE可降低骨化三醇（维生素D3的活性形式）和CYP24A1的水平，使细胞内Ca2+浓度增加。抑制MAPK信号通路可抑制CRC细胞生长。SQLE抑制剂terbinafine可抑制CRC细胞增殖、类器官和异种移植肿瘤的生长。结论 SQLE通过积累骨化三醇和激活CYP24A1介导的MAPK信号通路促进CRC生长，提示SQLE可作为潜在的CRC治疗靶点。【关键词】骨化三醇；细胞增殖；胆固醇生物合成；结直肠癌；CYP24A1；MAPK信号通路；鲨烯环氧酶；Terbinafine学研究所，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心，细胞生物学国家重点实验室，上海 200031，中国；4 复旦大学中山医院，生命科学学院基因工程国家重点实验室，上海 200438，中国；5 上海科技大学，生命科学与技术学院，上海 201210，中国；6 同济大学医学院附属杨浦医院普外科，上海 200090，中国原文链接：hfips:/doi.org/10.1002/cac2.12187结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是一种高发的恶性肿瘤，发病率和死亡率位列世界第三位1,2。CRC治疗的主要手段为手术切除及联合放疗、化疗和免疫治疗等辅助治疗3,4。目前，通过基因组和转录组测序检测生物标志物（如RAS和BRAF的扩展突变）表达情况，来预测CRC患者预后和指导治疗5。CRC510癌 症 2 0 2 2年 第 4 1卷 第 1 1期中有4种基因表达共识分子亚型（consensus molecular subtype，CMS）：CMS1（具有微卫星不稳定性的强免疫激活）、CMS2（具有上皮染色体不稳定性的经典型）、CMS3（代谢紊乱）和CMS4（基质侵犯）6。CMS3 CRC富含多种类型的代谢重编程，并与KRAS激活突变相关6。因此，可通过调控肿瘤代谢使肿瘤细胞恢复正常增殖，从而治疗CRC7,8。代谢紊乱是CRC的重要特征之一，包括葡萄糖代谢和氨基酸代谢紊乱及脂质代谢紊乱913。为满足异常活跃的生长所需，癌细胞改变了其原始的代谢模式14。癌细胞中上调的有氧糖酵解产生足够的ATP和过量的中间体，用于合成蛋白质和其他生物分子。癌细胞还可通过诱导谷氨酰胺转运蛋白（如溶质载体家族1成员5（solute carrier family 1 member 5，SLC1A5）表达直接摄入谷氨酰胺，用以合成蛋白质、增加葡萄糖摄取和激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）途径15。大多数癌细胞通过上调脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FASN）表达来加速脂肪酸等脂质的生物合成16。胆固醇是另一种必需的脂质，可以形成细胞膜、储存能量和合成癌细胞的生物活性激素17,18。有研究19,20报道，胆固醇摄入过多与CRC风险增加有关。高胆固醇水平不仅可通过影响细胞周期和抑制细胞凋亡促进癌细胞增殖和存活，还可通过抑制免疫反应和释放干扰素来引发癌细胞转移21,22。甲羟戊酸途径是胆固醇合成的重要途径，以乙酰辅酶A、NADPH和ATP合成甾醇类和类异戊二烯23。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR）作为重要的限速酶，是他汀类药物治疗癌症的作用靶点24。角鲨烯单加氧酶（squalene monooxygenase，SQLE）是另一关键的限速酶，它将角鲨烯合酶产生的角鲨烯转化为2,3-环氧角鲨烯。胆固醇水平低时，甾醇调节元件结合转录因子2（sterol regulatory element binding transcription factor 2，SREBP2）调控SQLE表达25；而胆固醇水平高时，SQLE通过泛素蛋白酶体系统被膜相关RING-CH型指蛋白6（membrane-associated ring-CH-type finger 6，MARCH6）降解26。SQLE在肝27和乳腺癌28中发挥重要作用。因此，靶向SQLE的抑制剂Terbinafine可能是一种有前景的癌症预防和治疗药物。然而，SQLE在CRC中的作用及其机制尚不明确。在本研究中，我们旨在研究SQLE在CRC发展中的病理作用及其分子机制，并评估SQLE抑制剂对CRC的治疗效果。1 方法和材料1.1 细胞和细胞培养人胚胎肾细胞系293T，CRC细胞系DLD1、HCT116、LS174T、RKO、SW480、SW620细胞在添加了10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；Cat#10091148；Gibco，Carlsbad，CA，USA）和1%青霉素/链霉素（Cat#15140122；Gibco，Carlsbad，CA，USA）的Dulbecco改良Eagle培养基（Dulbeccos Modified Eagle Medium，DMEM）（Cat#11995065；Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）中培养。HT29、HCT15、LoVo、Caco2细胞在添加了10%FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基（Cat#11875093；Gibco，Carlsbad，CA，USA）中培养。NCM460细胞在添加了10%FBS、20 ng/mL人表皮生长因子（human epidermal growth factor，hEGF）(Cat#E4269；Sigma，St.Louis，MO，USA）和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中培养。以上细胞均在37C、5%CO2条件下培养。所有细胞均来自中国科学院细胞库（上海，中国）。1.2 人组织样本和组织微阵列（tissue microarray，TMA）收集2015年1月至2018年12月期间，就诊于同济大学杨浦医院（上海，中国）的281例患者的CRC组织和212例癌旁组织样本（其中175例为与CRC组织配对的癌旁组织），所有患者均签署了知情同意书。所有组织样本均来自CRC患者（IIV期）的手术切除，并由杨浦医院的病理科医生进行诊断。用福尔马林固定组织，然后用石蜡包埋，用于构建TMA。本研究获得了同济大学杨浦医院伦理委员会的批准。1.3 免疫组化（immunohistochemistry，IHC）用二甲苯和乙醇对石蜡组织切片进行脱蜡。室温下，用3%H2O2处理15 min以阻断内源性过氧化物酶活性。将组织切片置于柠檬酸缓冲液中加热20 min以进行抗原修复。然后在37C下，置于含10%胎牛血清的PBS溶液中15 min以阻断非特异性511癌 症 2 0 2 2年 第 4 1 卷 第 1 1期结合。将载玻片与SQLE（1200稀释；Cat#12544-1-AP；Proteintech，Rosemont，IL，USA）、Ki67（15000稀释；Cat#ab15580；Abcam，Cambrige，CB2，UK）在4oC孵育过夜。使用通用SP试剂盒（Cat#SP-9000；ZSGB-BIO，北京，中国）将载玻片与生物素标记的二抗共同孵育，并加入DAB底物（Cat#SP-9000；ZSGB-BIO，北京，中国）。通过染色强度（03）和阳性细胞比例（04）对检测样本的免疫反应进行评分。1.4 构建质粒和稳定细胞系将 全 长 S Q L E 克 隆 到 p C D H-P U R O 载 体（Cat#46970；Addgene，Watertown，MA，USA）中。将SQLE短发夹RNA（short hairpin R N A，s h R N A）构 建 到 p L K O.1 P U R O 载 体（Cat#8453；Addgene，Water tow n，M A，USA）中，shR NA靶序列如下，shSQLE：5-GGTGTTGTGTTACAGTTAT-3；阴性对照：5-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG-3。使 用 L i p o f e c t a m i n e 3 0 0 0（Cat#L3000015;Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）将病毒载体（pCDH和PLKO.1）和包装质粒（psPAX2/pMD2.G；Cat#12259/12260；Addgene，Watertown，MA，USA）共转染HEK293T细胞。转染48 h后，通过0.45 m滤器（Cat#PN4614；PALL，Show Low，AZ，USA）过滤细胞培养基。用病毒培养基感染细胞48 h，然后用嘌呤霉素（Gibco；Cat#A1113803；Carlsbad，CA，USA）进行筛选以构建稳定细胞系。1.5 RNA干扰人CYP24A1和CACNG4小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）由Genepharm（上海，中国）合成。按照产品说明书，用Lipofectamine RNAiMAX（Cat#13778150；Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）转染siRNA寡核苷酸。本研究中使用的siRNA靶序列如下所列，siCACNG4-1：5-GGATCTACAGCCGCAAGAATT-3；siCACNG4-2：5-TCGTCTACATTTCCAGCAATT-3；siCYP24A1-1：5-GCTGCAGATTCTCTGGAAATT-3；siCYP24A1-2：5-GCAACAGCTGGGTGAAT-3。1.6 RNA提取和实时PCR分析使用Trizol试剂（Cat#15596026；Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）提取总RNA。按照产品说明书，使用RT master mix（Cat#RR036B；Takara，Mountain View，CA，USA）进行逆转录，使用SYBR Green（Cat#RR091A；Takara，Mountain View，CA，USA）进行实时PCR。用2-Ct方法分析数据。实时PCR的引物列见补充表S1。1.7 蛋白质印迹用 P B S 洗 涤 细 胞，加 入 R I P A 缓 冲 液（Cat#P0013B；Beyotime，上海，中国）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF；ST506，Beyotime，上