竞争法制备喹乙醇快速检测试纸条及其在鲫鱼检测中应用_林勃勃.pdf

-34-竞争法制备喹乙醇快速检测试纸条及其在 鲫鱼检测中应用 林勃勃1 韦庆敏1 刘 发1 罗志辉1,2,3 （1.玉林师范学院，广西 玉林 537000；2.广西农产资源化学与生物技术重点实验室，广西 玉林 537000；3.广西高校桂东南特色农产资源高效利用重点实验室，广西 玉林 537000）【摘 要】目的：在胶体金免疫层析技术的基础上采用竞争法制备喹乙醇快速检测试纸条。方法：采用一锅法合成显色用的胶体金，调控柠檬酸钠的量，获得不同最大吸收波长的胶体金。通过对胶体金吸收波长、碳酸钾添加量等条件的优化，获得胶体金的最大吸收波长为 522 nm、碳酸钾（0.2 mmol/L）添加量为 15 L 的最佳条件，在此最优条件下制备试纸条，考察试纸条的方法学参数，并将制备好的试纸条检测实际样品。结果：随着喹乙醇浓度的减小（5.310-1 mg/mL，5.310-7 mg/mL），试纸条的控制线 C 线一直显色，而检测线 T 线逐渐清晰、显色，表明试纸条是准确的，检出限为 5.310-7 mg/mL，所有的检测在58 分钟内能完成，并成功用于鲫鱼实际样品的检测。结论：该试纸条适用于对肉类中的喹乙醇残留进行高效灵敏的检测，有利于保障人们的食品安全。【关键词】喹乙醇；胶体金；竞争法；快速检测；试纸条【中图分类号】O657;S91 【文献标识码】A 【文章编号】1008-1151(2022)12-0034-05 Preparation of Rapid Detection Strip of Olaquindox for Competitive Method and Its Application in the Detection of Crucian Carp Abstract:Objective:On the basis of colloidal gold immunochromatography technology,competitive method was used to prepare rapid test strips for olaquindox.Methods:The colloidal gold for color development was synthesized by one pot method,and the amount of sodium citrate was adjusted to obtain colloidal gold with different maximum absorption wavelengths.By optimizing the absorption wavelength of colloidal gold and the addition amount of potassium carbonate,the maximum absorption wavelength of colloidal gold was 522 nm and the addition amount of potassium carbonate(0.2 mmol/L)was 15 L,prepare the test strip under this optimal condition,investigate the methodological parameters of the test strip,and test the actual sample with the prepared test strip.Results:With the decrease of olaquindox concentration(5.310-1 mg/mL,5.310-7 mg/mL),the control line C of the test strip showed color all the time,while the detection line T was gradually clear and colored,indicating that the test strip was accurate,and the detection limit was 5.310-7 mg/mL,all tests could be completed within 5 to 8 minutes,and successfully used for the detection of actual samples of crucian carp.Conclusion:The test strip is suitable for the highly efficient and sensitive detection of olaquindox residues in meat,which is conducive to ensuring the safety and health of human food.Key words:olaquindox;colloidal gold;competitive method;rapid detection;test strip 引言 喹乙醇是一种化学添加剂，分子量较小，也称倍育诺、奥喹多司和喹酰胺醇等，因其具有广谱抗菌性、能使蛋白质同化和提高饲料转化率等优点而广泛用于家禽和水产产品饲养中，促进使动物加速生长1。但研究发现长期使用或用量过大，累积在体内的喹乙醇会引发人体各类疾病，甚至有着明显的致畸形作用或致癌现象，因此，国内外对喹乙醇的使用都用明显的限制2-6。2005 年，我国明确规定喹乙醇不能用于家禽和水产养殖当中7，然而，近年来，一些不法商家为了追总第 24 卷 280 期 大 众 科 技 Vol.24 No.12 2022 年 12 月 Popular Science&Technology December 2022 【收稿日期】2022-09-29【基金项目】国家自然科学基金（22064018）；广西自然科学基金（2019JJA120031、2019GXNSFAA245026）；玉林市科技攻关项目（201934012）；学校高层次人才科研启动项目（G2020ZK04、G2021ZK15）；广西教育厅人才项目（2018-18）；大学生创新项目（201910606143）。【作者简介】林勃勃（1998），女，玉林师范学院学生，从事食品快速方法研究。【通信作者】罗志辉，男，玉林师范学院教授，从事纳米材料的制备及其分析应用、食品安全检测研究。-35-求更大的利益和降低生产成本，不顾国家规定，滥用喹乙醇，关于食用含有喹乙醇残留的水产禽畜而引发的食品安全问题层出不穷8。因此，建立一种快速、便捷、灵敏、准确的喹乙醇检测现场快检方法迫在眉睫。目前对喹乙醇进行检测的主要方法有：（1）液相色谱-质谱联用技术，曾静等9采用此方法检测水产品中喹乙醇残留量得出检出限为 10 g/kg，此方法的检出限低且回收率高，浓度在 0.5 g/L500.0 g/L 时线性关系良好，适用于检测水产品中的喹乙醇残留；（2）超高压色谱-质谱法10,11，师真等12采用超高效液相色谱-串联质谱法测定罗非鱼中喹乙醇，测得检测限为 0.005 mg/kg；（3）免疫法，免疫法包括了胶体金免疫层析法13,14、酶联免疫分析法15、荧光微球免疫层析16,17；（4）电化学分析法18，电化学分析法中能较好地对喹乙醇分析和测定的方法是溶出伏安法，有研究表明19，使用溶出伏安法检测喹乙醇残留的检出限为 710-1 mol/L。（5）高效液相色谱法，谢小华等20采用 ODS 柱分离喹乙醇，并将此方法用于检测草鱼、鲫鱼等水产品的喹乙醇。这些方法大多具有灵敏度高、重复性好等特点，在食品、水产品安全检测中起到重要的作用。但这些方法大多数需要专业人员操作大型精密仪器进行检测，步骤较为繁琐，不适合现场大批量检测，而免疫层析法具有操作方便、检测时间短、设备便携等特点，可广泛适用于现场检测，进行大面积推广。胶体金免疫层析试纸法是实现快速、便捷、灵敏、准确检测的方法之一21,22，广泛用于生化23,24、环境25、食品26,27等方面的检测。然而，由于喹乙醇分子量较小，采用传统的双抗免疫夹心法来构建胶体金快速检测试纸条，结合位点较少，比较容易出现假阳性。因此，本研究提出采用竞争法制备喹乙醇的快速检测试纸条，以胶体金为显色剂，与喹乙醇抗体构建具有靶向性的捕获探针，采用喹乙醇-BSA 作为检测线的捕获剂，通过待测样品中是否有喹乙醇与金标抗体共同竞争结合，在检测线上是否会显色来判断阳性或者阴性。如果检测线和质控线都显色，结果判断为阴性；如果检测线不显色，质控线显色则检测结果为阳性。检测线的显色逐渐增强说明喹乙醇浓度越小，实现对喹乙醇实际样品定性和半定量检测。1 材料与方法 1.1 材料与试剂材料与试剂 氯金酸（分析纯，天津市光复精细化工研究所）；柠檬酸三钠、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、甲醇、碳酸钾和牛血清白蛋白（BSA）（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；喹乙醇（分析纯）、喹乙醇抗体和喹乙醇-BSA（生化试剂，试上海羽朵生物科技有限公司）；羊抗鼠二抗（IgG）（生化试剂，宁波高新区海辰生物科技有限公司）；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜（NC 膜）、吸水滤纸（上海金标生物科技有限公司）；鲫鱼购自玉林名山农贸市场。1.2 仪器与设备仪器与设备 Cary 5000 紫外可见分光光谱仪（美国安捷伦公司）；TecnaiG20 透射电子显微镜（美国 FEI 公司）；H1850R 台式低速自动平衡离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；HM3035 三维划膜喷金仪、CTS300 数控裁条机、YK725 压壳机（上海金标生物科技有限公司）；DHG-9146A 电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏仪器设备有限公司）。1.3 胶体金的合成胶体金的合成 本研究按照经典的柠檬酸三钠还原法制备胶体金28，做适当修改。在实验前先将所有要用到的玻璃仪器放在王水浸泡 25 min，再取出分别用蒸馏水、超纯水各洗 3 次，最后置于烘箱，烘干保存。拿出以上烘干仪器，用分析天平称量0.0326 g 的柠檬酸三钠，用量筒量取 100 mL 超纯水加入到250 mL 三颈烧瓶中，然后在 100 的水浴条件下加热回流，并不断搅拌 15 min，加入 925 L 的 48 mmol/L mM 的氯金酸，溶液首先出现灰蓝色，其次到蓝色、黑蓝色、紫红色，最终变为酒红色，变为酒红色后再持续加热搅拌 15 min，即可得胶体金溶液，取下自然冷却、装瓶，于冰箱中 28保存。1.4 碳酸钾的用量碳酸钾的用量 取 5 支离心管，分别往里加入 1 mL 胶体金，分别加入0 L、15 L、25 L、35 L、45 L 的 0.2 mol/L 碳酸钾溶液，两个小时后，观察离心管中胶体金溶液的颜色，若仍保持为酒红色，则为最佳的用量以稳定溶液的弱碱性和离子强度。1.5 金标探针制备与纯化金标探针制备与纯化 取 1 mL 的胶体金，加入 10 L 的 1 mg/mL 喹乙醇抗体，充分震荡摇匀 8 min，静止 2 h，加入 50 L 10%BSA 封闭，放置于冰箱内 28保存过夜，所标记的探针以 5 083 g 进行离心 10 min，用移液枪吸走上清液，弃去，留下的沉淀用 pH为 8 的 Tris-HCl 缓冲盐溶液（TBS）复溶，置于冰箱中 28保存，待用。1.6 试纸条的制备试纸条的制备 试纸条组装按照经典的四步法进行29,30。首先，取出聚氯乙烯底板，测量底板每一部分的长度和宽度，进行每一部分原材料适宜宽度和长度的剪裁。接着，将喹乙醇-BSA 和羊抗鼠二抗用 XYZ 三维划线膜喷金仪划线到 NC 膜上，同时将金探针喷于结合垫上。然后将样品垫、金标结合垫、NC 膜和吸水垫依次组装在底板上，为了保证试纸条的流动性良好，在组装时各部分要有一定的重叠，重叠 1 mm 左右即可。最后，为保证试纸条的使用寿命，将制