鉴定铁死亡相关基因作为狼疮性肾炎诊断生物标志物的研究_吴昱升.pdf

论著基础研究鉴定铁死亡相关基因作为狼疮性肾炎诊断生物标志物的研究基金项目:国家自然科学基金(81860131，82060133);广西自然科学基金(2017GXNSFAA198288，2019GXNSFDA245004)作者简介:吴昱升，男，在读硕士研究生，研究方向:足细胞损伤与修复。E-mail:824596620 qqcom通信作者:林栩。E-mail:linyyfyy 163com 本文引用格式 吴昱升，林栩，王蓉，等鉴定铁死亡相关基因作为狼疮性肾炎诊断生物标志物的研究 J 右江医学，2023，51(1):6-14吴昱升1，2，林栩1，2，王蓉1，2，黄慕源1，2，徐璐瑶1，2，张洁1，2，杨岚茵1，2，蓝梦麟1，2(1右江民族医学院附属医院肾内科，广西百色 533000;2广西免疫相关性疾病医学科研基础保障重点实验室，广西百色 533000)【摘要】目的以铁死亡相关基因(ferroptosis-related genes，FGs)为目的基因筛选狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)的生物标志物。方法分别从基因表达数据库和 FerrDB 数据库下载 LN 相关数据和 FGs。接着使用差异表达分析、加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)、LASSO(least absolute shrinkageand selection operator)回归和支持向量机递归特征消除筛选关键基因，并绘制受试者工作特征(receiver operatingcharacteristic，OC)曲线评估关键基因的诊断能力，并验证诊断基因的表达量。结果本研究鉴定出 2 个关键基因(PTEN 和 N4A1)，关键基因的 OC 曲线下面积均大于079，且 PTEN 在 LN 样本中高表达，N4A1 在 LN 样本中低表达。结论PTEN 和 N4A1 的发现为 LN 铁死亡相关研究提供了新的视角。【关键词】狼疮性肾炎;铁死亡;生物标志物;诊断基因中图分类号:59324+2文献标志码:ADOI:103969/jissn1003-1383202301002A study on identification of ferroptosis-associated genesas diagnostic biomarkers for lupus nephritisWU Yusheng1，2，LIN Xu1，2，WANG ong1，2，HUANG Muyuan1，2，XU Luyao1，2，ZHANG Jie1，2，YANG Lanyin1，2，LAN Menglin1，2(1 Department of Nephrology，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China;2 Guangxi Key Laboratory of Basic Guarantee for Medical esearch of Immune-related Diseases，Baise 533000，Guangxi，China)【Abstract】ObjectiveTo screen biomarkers of lupus nephritis(LN)using ferroptosis-related genes(FGs)as targetgenes MethodsLN-related data and FGs were downloaded from the Gene Expression Omnibus(GEO)database andFerrDB database，respectively Subsequently，differential expression analysis，weighted gene co-expression network analysis(WGCNA)and FGs，least absolute shrinkage and selection operator(LASSO)and support vector machine(SVM)recur-sive feature elimination were used to screen key genes eceiver operating characteristic(OC)curve was plotted to assessthe diagnostic ability of key genes，and the expression of diagnostic genes was verified esultsTwo key genes(PTEN andN4A1)were obtained in this study，and the area under OC curves(AUCs)of the key genes were greater than 079PTEN was highly expressed in LN samples，while N4A1 was low expressed in LN samples ConclusionThe findings ofPTEN and N4A1 provide new perspectives for LN ferroptosis-related studies6右江医学 2023 年第 51 卷第 1 期Chinese Youjiang Medical Journal 2023，Vol51 No1【Key words】lupus nephritis;ferroptosis;biomarkers;diagnostic genes系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种涉及对内源性核颗粒的不适当免疫反应1，狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)是 SLE 最常见和最严重的靶器官表现之一2。10%30%的 LN 患者在确诊后 15 年内发展为终末期肾病(end-stage re-nal disease，ESD)，这是 SLE 死亡的主要原因3。最近的研究表明，LN 易感基因(破坏免疫耐受)可以增强先天免疫信号通路，促进淋巴细胞活化，从而导致肾损伤4。铁死亡是一种新发现的程序性细胞死亡，其特点是产生脂质活性氧(reactive oxygen species，OS)和铁超载，导致胱天蛋白酶和坏死体非依赖性细胞死亡。中性粒细胞铁死亡在狼疮发病机制中起到关键作用，铁死亡抑制剂治疗可以显著改善狼疮小鼠的疾病严重程度5。本研究以铁死亡相关基因(ferroptosis-related genes，FGs)为目的基因筛选 LN的生物标志物，旨在为 LN 的治疗提供新的策略。1材料与方法1111数数据据来来源源从 GEO 数据库(Gene ExpressionOmnibus，https:/www ncbi nlm nih gov/geo/query)下载 LN 患者的转录组数据和临床数据。GSE32591数据集包含 93 例肾小管间质样本和肾小球样本，提取肾小球样本为本研究的研究对象，其中包含 14 例正常样本和 32 例 LN 患者。GSE157293 数据集包含3 例正常样本和 3 例 LN 患者的长链非编码 NA(long noncoding NA，lncNA)和 miNA 表达数据。此外，从 FerrDB 数据库(http:/www zhounan org/ferrdb)中获得了 349 个 FGs，包括激活基因、抑制基因和标记基因。1212方方法法12 112 1差 异差 异 分分 析析使 用“limma”软 件 筛 选GSE32591 数据集中的 14 例正常样本和 32 例 LN 样本之 间 的 差 异 表 达 基 因(differentially expressedgenes，DEGs)，筛选标准为 P005，|Log2FC|05，利用“ggplot”和“pheatmap”包绘制 DEGs 的火山图和热图。122122差异表达差异表达的的 LNLN 相关相关基基因因(LN-related DEGsLN-related DEGs，LN-DEGsLN-DEGs)的的筛选筛选本研究使用“WGCNA”包进行加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expres-sion network analysis，WGCNA)，用 good SamplesGenes 函数来过滤离群样本。为了确保基因之间的相互作用最大限度地符合无尺度分布，首先确定了软阈值。设置每个模块的最小基因数为 100，通过动态剪切树算法合并模块，设置 MEDissThres 为02来合并相似的模块。最后分析 LN 与模块之间的相关性来寻找 LN 相关基因(LN-related genes，LNGs)，并将 DEGs 和 LNGs 相交得到 LN-DEGs。123123功功能能富集富集分分析析为了寻找 LN-DEGs 的功能和相关通路，使用“clusterProfiler”包进行 GO 和KEGG 富集分析，P005 为显著富集。124124蛋白质互蛋白质互作作网络网络(protein-protein interactionprotein-protein interaction，PPIPPI)为了研究 LN-DEGs 之间的相互作用，使用STING(https:/string-dborg)网站构建蛋白质相互作用网络，并选择置信水平为 04。125125筛选诊断筛选诊断基基因因将上述 LN-DEGs 与 349 个FGs 取交集，得到狼疮性肾炎-铁死亡相关差异表达基因(LN-F DEGs)。使用“glmnet”包对 LN-F DEGs 进 行 LASSO 回 归 分 析。同 时，利 用“e1071”包对 LN-F DEGs 进行支持向量机递归特征消除(support vector machine recursive featureelimination feature，SVM-FE)分析，获得特征基因。将 LASSO 和 SVM 得到的特征基因取交集，并绘制受试者工作特征(OC)曲线，得到诊断基因。126126免免疫细胞疫细胞与与诊断诊断基基因因的的相关性相关性分分析析用“GSVA”包计算 LN 和正常样品中 23 种免疫细胞的含量，并通过 Wilcoxon 秩和检验比较两组样品中的免疫细胞含量。并通过 Pearson 相关分析探索 23种免疫细胞与诊断基因的关系。127CeNA127CeNA 网络网络分分析析使用“DESeq2”包筛选GSE157293 数 据 集 中 的 差 异 miNA 和 差 异 ln-cNA，筛选条件为 P005 和|Log2FC|05。然后我们使用 miWalk 网站，设置置信水平为 1，预测与上述交叉 miNA 结合的 lncNA，与差异 lncNA 取交集。用上述交叉 miNA，lncNA 和诊断基因构建ceNA 网络。128128诊断诊断基基因表达量因表达量的的验证验证为了验证诊断基因的表达量，分别在 GSE32591 和 GSE157293 数据集中比较了 LN 样本和正常样本的同源性磷酸酶-张力7右江医学 2023 年第 51 卷第 1 期Chinese Youjiang Medical Journal 2023，Vol51 No1蛋白(phosphatase and tensin homolog，PTEN)和孤束核受体 4A1(N4A1)的表达。2结果2121差异差异分分析析本研究共筛选出了 1221 个 DEGs，包括694 个上调基因，527 个下调基因。热图展示了DEGs 的表达(图 1)。2222差异表达差异表达的的 LNLN