经典瞬时感受器电位通道对内...殖所引起的阻塞性病变的影响_闫文丽.pdf

黑龙江医学2023年2月25日第47卷第4期HEILONGJIANG MEDICAL JOURNALFeb.25,2023Vol.47No.4在全球每年死亡人数中，心血管疾病占1/3，我国心血管疾病死亡率也居高不下1。动脉粥样硬化是冠心病、脑卒中及心肌梗死等心血管疾病的发病基础。怎么预防及治疗心血管疾病，是目前医学研究的热点。深入研究动脉粥样硬化的发病机制及探索其靶点非常重要。经典瞬时感受器电位通道（TRPC）是Ca2+身体性非选择性的阳离子通道，TRPC6能介导受体操纵的钙流入，表达参与疾病的发生、发展，尤其在心血管相关疾病的病理过程中有着重要作用2。本研究就TRPC对内皮细胞和平滑肌细胞增殖所引起的阻塞性病变的影响进行了探讨，现将结果报告如下。1资料与方法1.1一般资料1.1.1人体实验选取尸检标本进行研究，尸检标本选择经典瞬时感受器电位通道对内皮细胞和平滑肌细胞增殖所引起的阻塞性病变的影响闫文丽1，唐学义2，张晓宇21.安阳市第六人民医院呼吸危重症科，河南安阳455000；2.河南省人民医院 郑州大学人民医院呼吸与危重症医学科，河南郑州450003摘要目的：探讨经典瞬时感受器电位通道（TRPC）对内皮细胞和平滑肌细胞增殖所引起的阻塞性病变的影响。方法：选取人体尸检标本的颈动脉中明显有动脉粥样硬化的组织进行处理后经染色检测其TRPC6蛋白表达情况。取小鼠饲养高脂饲料12周后建模对比常规喂养组的TRPC6斑块表达情况。基因敲除后，动脉动脉粥样硬化斑块中的平滑肌细胞及胶原纤维含量情况、血管壁增厚及血流阻力情况。结果：TRPC6在人体动脉粥样硬化斑块中的表达显著更高，经免疫组织化学（IHC）染色其平均光密度显著更高。小鼠模型组（0.0040.010）高于对照组（0.0630.012），差异有统计学意义（P0.05）。基因敲除后，模型小鼠的动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞含量（16.551.12）显著少于之前的（28.212.23），差异有统计学意义（P0.05）；平滑肌细胞（27.262.51）显著高于之前的（20.921.61），差异有统计学意义（P0.05）；而胶原纤维差异不明显。基因敲除后，能明显改善小鼠的血管壁增厚及血流阻力情况。结论：TRPC6在动脉粥样硬化斑块中的表达显著调高，提示其参与了动脉粥样硬化斑块的发生及发展过程。关键词经典瞬时感受器电位通道；内皮细胞；平滑肌细胞增殖；阻塞性病变doi10.3969/j.issn.1004-5775.2023.04.004学科分类代码320.2410中图分类号R54文献标识码BEffects of Classical Transient Receptor Potential Channels on Obstructive Lesions Caused by Proliferation of Endothelial Cells and Smooth Muscle Cells/YAN Wen-li,TANG Xue-yi,ZHANG Xiao-yu/Department of Respiratory Critical Care,Anyang Sixth People s Hospital,Anyang,Henan,455000,ChinaAbstract Objective:To investigate the effect of classical transient receptor potential channels(TRPC)on obstructive lesionscaused by proliferation of endothelial cells and smooth muscle cells.Methods:Tissues with apparent atherosclerosis in the carotidarteries of human autopsy specimens were taken for processing and stained to detect their TRPC6 protein expression.Mice weretaken and modeled after 12 weeks of feeding high-fat chow,and TRPC6 plaque expression in the conventionally fed group wascompared.After gene knockdown,the smooth muscle cell and collagen fiber content in the atherosclerotic plaque,vessel wall thickeningand blood flow resistance were observed.Results:TRPC6 expression was significantly higher in human atherosclerotic plaques,and its mean optical density was significantly higher by immuno histochemistry（IHC）staining.It was(0.0040.010)in themouse model group,which was higher than(0.0630.012)in the control group,and the difference was statistically significant(P0.05).After gene knockdown,the content of macrophages in atherosclerotic plaques of model mice was(16.551.12),significantlyless than before(28.212.23),with statistically significant differences(P0.05).Smooth muscle cells were(27.262.51),significantly higher than the previous(20.921.61),with a statistically significant difference(P0.05),while the difference in collagen fibers was not significant.The gene knockout significantly improved blood vessel wall thickening and blood flow resistance in mice.Conclusion:The expression of TRPC6 was significantly elevated in atherosclerotic plaques,suggesting its involvement in thedevelopment and progression of atherosclerotic plaques.Keywords Classical transient receptor potential channel;Endothelial cells;Smooth muscle cell proliferation;Obstructive lesions400黑龙江医学2023年2月25日第47卷第4期HEILONGJIANG MEDICAL JOURNALFeb.25,2023Vol.47No.4生前患有高血压及脑血管疾病者。此次检测方案经医院伦理委员会批准通过。尸检标本的尸解经其家属同意后实行。1.1.2动物实验周龄为6周的、购于北京维通利华公司的ApoE-/-小鼠为模型组，经高脂饲料喂养2周；购于空军军医大中心的C57BL/6J小鼠为对照组，经普通饲料喂养12周。ApoE-/-小鼠经C57BL/6J小鼠回交10代以上做基因敲除。1.2方法1.2.1经免疫组织化学法检测颈动脉斑块中TRPC6表达取颈动脉分叉位置，血管壁出现动脉粥样硬化明显的斑块组织进行检测，并取其周围血管壁病变不明显的组织为对照组。去除残留血液、石蜡包埋；制作切片；烘箱融化石蜡、甲苯、梯度乙醇水化；抗原修复；透膜、内源过氧化氢酶灭活；封闭；孵育；显色；苏木素染色液复染；脱水等处理后，树胶封片，显微镜拍照，取5个视野经分析图像计算平均光密度，取均值。1.2.2小鼠建模后于其腹腔注射戊巴比妥钠麻醉将胸腹腔打开，灌注34 mL生理盐水至左心室至肝脏发白，随脊柱分离主动脉，一起剪下心脏，放入PBS缓冲液干粉，显微镜下剥离心脏和血管组织，沿主动脉根部剪下心脏，纵向剖开主动脉为Y型。把主动脉放入4%多聚甲醛中24 h、油红O染液浸染4 h，再用异丙醇分化多次至动脉粥样硬化斑块为红色、动脉壁为白色。经蒸馏水冲洗后拍照，经Image-Pro Plus 6.0统计整个主动脉面积中的斑块面积占比。另外经免疫组织化学法检测小鼠主动脉的动脉粥样硬化斑块中的TRPC6表达。基因敲除后，经CD68免疫组织化学染色法检测小鼠主动脉的动脉粥样硬化斑块中平滑肌细胞含量，经天狼猩红染色法检测动脉粥样硬化斑块中的胶原纤维含量。采用超声影像技术检测小鼠的颈部总动脉情况。1.3观察指标（1）TRPC6 在颈动脉动脉粥样硬化中的表达情况。（2）高脂饲养下的动脉粥样硬化形成情况。（3）TRPC6在小鼠主动脉动脉粥样硬化中的表达情况。（4）基因敲除后，动脉动脉粥样硬化斑块中的平滑肌细胞及胶原纤维含量情况。（5）基因敲除后，血管壁增厚及血流阻力情况。2结果2.1石蜡切片中的IHC染色结果动脉粥样硬化不明显的血管中，其血管内膜及中膜上均有TRPC6表达。而有明显动脉粥样硬化的血管中，血管形态破坏改变，中膜变薄，血管内斑块组织较多，TRPC6表达显著更高。经Image-Pro Plus6.0计算IHC阳性染色平均光密度值显示，动脉粥样硬化血管发生明显的平均光密度为（0.0060.001），未有明显动脉粥样硬化平均光密度为（0.0410.012），动脉粥样硬化血管发生明显的显著更高，差异有统计学意义（P0.05）。2.2高脂饲料喂养的小鼠经高脂饲料喂养12周后的小鼠动脉上出现明显的动脉粥样硬化斑块。说明高脂饲料喂养 12 周后的小鼠建模成功。2.3IHC检测结果经IHC检测法显示，对照组小鼠血管壁上的TRPC6表达弱，模型组动脉粥样硬化斑块有明显的TRPC6阳性显示。经软件统计其阳性染色平均光密度值，模型组（0.0040.010）高于对照组（0.0630.012），差异有统计学意义（P0.05）。2.4基因敲除后结果对小鼠进行基因敲除后，经CD68抗体免疫染色评价出其巨噬细胞含量，经-SMA评价平滑肌细胞含量，经天狼猩红染色评价胶原纤维含量。巨噬细胞增多，平滑肌细胞、胶原纤维减少会提高动脉粥样硬化斑块易损性。模型小鼠的动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞含量（16.551.12）显著少于对照组（28.212.23），差异有统计学意义（P0.05）；平滑肌细胞（27.262.51）显著高于对照组（20.921.61），差异有统计学意义（P0.05）；而胶原纤维差异不明显。结果提示，基因敲除后，动脉粥样硬化小鼠的斑块稳定性更高。2.5常规喂养的小鼠常规喂养的小鼠颈动脉血管舒张内径、血管收缩内径、血管壁厚度、血流阻力指数无明显的差异。高脂饲料喂养小鼠的动脉血管舒张内径、血管收缩内径有明显的缩小，血管壁厚度有明显增厚，血流阻力指数有明显升高，表明造模会引起颈动脉血管功能障碍。基因敲除后小鼠和高脂小鼠比较，颈动脉血管舒张内径从（0.430.03）mm增 大 到（0.53 0.01）mm，差 异 有 统 计 学 意 义（P0.05）；血管收缩内径从（0.360.02