聚已亚甲基盐酸对重组蛋白A溶液的抑菌作用研究_张海珍.pdf

第 38 卷第 4 期2022 年 11 月 广东农工商职业技术学院学报JournalofGuangdongAgricultureIndustryBusinessPolytechnicVol.38 No.4Nov.2022聚已亚甲基盐酸对重组蛋白 A 溶液的抑菌作用研究张海珍,杨文俊,杨正根（广州康盛生物科技股份有限公司，广东广州，510660）摘要：本文选取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉 5 种菌种为指示菌，测定重组蛋白 A 溶液中抑菌剂聚已亚甲基盐酸（PHMB）的抑菌活性，并测定抑菌剂对蛋白活性的影响。结果表明，PHMB 的最低有效浓度为1.5g/L，加入适宜的抑菌剂对蛋白浓度和蛋白活性没有影响，蛋白可以室温储存 12 个月以上，可以作为蛋白溶液的储存液。关键词：聚已亚甲基盐酸；抑菌剂；蛋白中图分类号：Q93文献标识码：A文章编号：1009-931X(2022)04-0026-04收稿日期：2022-10-21作者简介：张海珍（1985），女，山西运城人，硕士，工程师。研究方向：重组蛋白表达，纯化及吸附产品。通讯作者：杨正根（1982），男，江西宜春人，硕士，工程师。研究方向：生物医用材料与血液净化产品。金黄色葡萄球菌蛋白 A 能与人类及多种哺乳动物血清中免疫球蛋白分子的 Fc 段特异性结合，在抗体纯化用亲和层析介质1,2及医学领域均有广泛的应用1。为防止蛋白 A 溶液在冷藏或常温储存过程中可能发生的微生物污染、延长保存时间，需要在保存液中加入抑菌剂。聚已亚甲基盐酸（PHMB）是目前公认的较安全的抑菌剂3，对细菌和真菌的杀灭效果均较好4-5,被广泛用于新型抑菌材料的研发6-8。本文对 PHMB 不同浓度及不同时间处理后，重组蛋白 A 溶液中的菌数下降情况进行比较研究，以期为同类重组蛋白制品中抑菌剂的选择提供参考。一、材料与方法（一）材料与仪器大 肠埃希菌（Escherichiacoli）CMCC（B）44102、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）CMCC（B）26003、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CMCC(B)10104、白 色 念 珠 菌（Candidaalbicans）CMCC（F）98001 及黑曲霉(Aspergillusniger)CMCC（F）98003 均为购买自中国药品生物制品检定所的标准菌株，菌数传代为第二代。胰蛋白胨大豆肉汤（琼脂）培养基、沙氏葡萄糖（琼脂）培养基、氯化钠-蛋白胨缓冲液为广东环凯微生物科技有限公司生产。PHMB（20%）购自广州市拓瑞化工科技有限应用研究公司；BCA 试剂盒购自 Thermo 公司；琼脂糖购自 GE公司；高碘酸钠购自天津福晨化学试剂厂；重组蛋白 A 溶液、人 IgG 溶液、PBS 溶液、洗脱溶液由本实验室制备。实验仪器有 ZQWY-200N 型卧式恒温振荡器（上海知楚仪器有限公司）、UV-2600 型紫外分光光度计（日本岛津）和 LRHS-205F-11 恒湿恒温培养箱（上海龙跃仪器设备有限公司）。（二）实验方法1.菌液的制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌甘油菌接种至 20ml 胰酪大豆胨液体培养基中，35培养 24h，离心收集菌体，然后用 0.9%无菌氯化钠溶液稀释并制成 108cfu/ml 的菌悬液。白色念珠菌甘油菌接种至20ml沙氏葡萄糖液体培养基中，25培养 48h，离心收集菌体，然后用 0.9%无菌氯化钠溶液稀释并制成 108cfu/ml 的菌悬液。黑曲霉接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基，25培养 57d，然后用含 0.05%聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液将表面的孢子洗脱，制成 108cfu/ml 的孢子悬液。各菌株的菌悬液同时用平皿法作活菌计数。2.供试液的制备取广州康盛生物科技有限公司生产的无菌无热原的重组蛋白 A 溶液，用无菌生理盐水稀释至终浓度约5mg/ml，分装至储液瓶中，然后加入PHMB溶液。27第 4 期张海珍，等：聚已亚甲基盐酸对重组蛋白 A 溶液的抑菌作用研究3.计数方法验证采用培养基稀释法消除供试液的抑菌活性。分别加入相应溶液于无菌平皿后，立即倾入温度不超过45的琼脂培养基，混匀凝固，倒置培养，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。细菌使用胰蛋白胨大豆琼脂培养基，35培养24h；真菌使用沙氏葡萄糖琼脂培养基,其中白色念珠菌25培养 48h，黑曲霉 25培养 57d。（1）试验组：取制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使供试液中含菌量不大于 100cfu/ml。（2）供试品对照组：取制备好的供试液，以生理盐水代替菌液同试验组操作。（3）菌液对照组：以生理盐水替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值应不小于菌液对照组菌落数值的 50%。4.抑菌效力测定将含 PHMB 的供试液分装于无菌储液瓶中，每瓶 100ml，按接菌量 105106cfu 接入各个菌株的菌悬液或孢子悬液。充分摇匀后，从三角瓶中取出 1ml，用氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释 10-310-5后倒平板，得到 0 时溶液中的初始菌落数。然后放置不同时间后分别从三角瓶中取样 1ml，采取平皿法计数。其中，每个稀释度 2 个重复，计算平均菌落数。2020版中国药典9规定抑菌效力判断标准见表 1，应符合 A 的抑菌效力。5.重组蛋白 A 溶液稳定性测定在重组蛋白 A 溶液中加入 PHMB，使其终浓度为 0.15%（1.5g/L），常温放置（1030）12 个月，分别在 0、3、6、9、12 个月取出部分样品，测定蛋白浓度及蛋白活性以考察蛋白的稳定性。其中，蛋白浓度用 BCA 试剂盒进行测定。蛋白活性的测定是将重组蛋白 A 偶联至琼脂糖 Sepharose6FF 上，评价免疫吸附材料的吸附性能。吸附剂的合成：取 5ml 琼脂糖凝胶用 50ml 纯抑菌剂名称菌种名称E.coliP.aeruginosaS.aureusC.albicansA.niger0.04%PHMB100 倍400 倍1000 倍400 倍400 倍0.15%PHMB_1500 倍表 2各试验菌株的最低稀释倍数表 1抑菌效力测定标准减少的 lg 值6h24h7d14d28d细菌A23_NRB_13_NI真菌A_2_NIB_1NI注：NR 试验菌未恢复生长；NI 未增加，是指对前一个测定时间，试验菌增加的数量不超过 0.5lg。化水清洗后与 20ml 浓度为 0.05mol/L 的高碘酸钠溶液混合置于三角瓶中，30，150rpm避光反应3h，用 50ml 的纯化水洗涤；然后加入 10ml 的重组蛋白A 溶液（pH8.4 的硼酸盐缓冲液），30，150rpm 避光反应4h，用50ml的纯化水清洗；加入10mlpH7.6的磷酸盐缓冲液及 2.5ml 乙醇胺溶液进行封端，于30、150rpm 避光反应 1h；最后分 3 次加入 0.1g的硼氢化钠还原 12h；用 50ml 的纯化水清洗即可。吸附性能的测定采用静态吸附法：取合成的吸附剂 1ml 于一次性层析柱中，用 20ml 的 PBS 溶液平衡后，加入 45mg 的人IgG 溶液，28、120rpm 吸附 1h，然后加入 8ml洗脱溶液，28、120rpm 洗脱 15min，收集洗脱液。用可见紫外分光光度计在200400nm 进行图谱扫描，记录 278nm 处的吸光度，即 OD278。吸附性能（mg/ml）=（(OD278V洗脱（ml）稀释倍数）/1.38注：1.38 为 IgG 质量浓度标准曲线测定系数。二、结果与分析（一）计数方法验证通过测定，按照试验组的菌回收率大于 50%的要求，当 PHMB 浓度为 0.04%时，大肠埃希菌至少需要稀释 100 倍才能消除抑菌作用；铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉至少需要稀释 400 倍消除抑菌作用；金黄色葡萄球菌至少需要稀释 1000 倍才能消除抑菌作用。当 PHMB 浓度为 0.15%至少需要稀释 1500 倍才能消除抑菌作用（见表 2）。（二）不同浓度的 PHMB 抑菌效力测定PHMB 对 细 菌 的 抑 菌 作 用 较 强，0.04%的PHMB 溶液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的抑菌作用均能达到 2020 版药典要求。0.04%的 PHMB 溶液对白色念珠菌的抑菌作用也能达到28第 38 卷广东农工商职业技术学院学报菌种名称PHMB 浓度(%)原菌数（0d）6h24h放置 7d放置 14d放置 28dS.aureus0.047.0106103103103P.aeruginosa0.045.0106103400400E.coli0.044.0106103400100C.albicans0.043.01064005000mg/kg，属无毒物质，PHMB 是（三）蛋白浓度的测定按照试剂盒说明书测定不同时间所取样品的蛋白浓度，重组蛋白 A 初始浓度为 5.040.22mg/ml,放置 3 个月后测定蛋白浓度为 5.100.18mg/ml,放置 6 个月后测定蛋白浓度为 4.850.11mg/ml,放置9 个月后测定蛋白浓度为 5.110.26mg/ml,放置 12个月后测定蛋白浓度为 5.120.08mg/ml。放置 12个月后，蛋白浓度与初始值相比未下降。用 SPSS9.0软件进行单样本 T 检验，测定第 3、6、9、12 个月的样品与 0 个月的样品差异不显著（P=0.944），在误差范围内认为重组蛋白 A 的蛋白浓度未下降（见图 1）。表 4较高浓度 PHMB 对黑曲霉的抑菌作用PHMB 浓度原菌数（0d）7d14d28d0.06%1.110651042.11040.08%1.110661042.71040.1%6.331051.510351030.15%6.331053.3*10315000369121.02.03.04.05.06.07.0 (mg/ml)0369122021222324252627282930(mg/ml)图 1 不同时间下蛋白浓度的变化图 2 不同时间下蛋白活性的变化29第 4 期张海珍，等：聚已亚甲基盐酸对重组蛋白 A 溶液的抑菌作用研究目前最安全无毒高效的消毒剂3。本研究通过测定PHMB 作为蛋白溶液中的抑菌剂的抑菌效果，结果显示在低有效浓度为 1.5g/L 时能够完全达到 2020版药典规定的 A 类抑菌剂抑菌效力的要求，且对蛋白浓度及蛋白活性影响不大，可以作为蛋白溶液的抑菌剂进行推广应用。参考文献：1 刘晓歌.融合蛋白AG的高效制备研究 D.浙江大学,2020.2 韩依珂,吴勇,赵伟,等.金黄色葡萄球菌蛋白A突变体的表达纯化与亲和色谱填料的制备 J.中国医药工业杂志,2019,50(7):755-761.3 ReregistrationEligibilityDecision(RED)forPHMB,UnitedStatesEnvironmentalProtectionAgency,2004.4 冯亚明,杨智景,顾海龙,等.聚六亚甲基双胍对金鱼嗜水气单胞菌的杀灭及金鱼细菌性疾病的治疗效果 J.贵州农业科学,2020,48(08):82-86.5 谭静文,徐红,宋金凤,等.聚六亚甲基双胍体外抗真菌作用研究 J.中国真菌学杂志,2020,15（2）:93-96.6 陈翔,刘耀,倪睿,等.负载聚六亚甲基双胍丝素蛋白纳米粒子抗菌活性及释放性能评价 J.中国药业,2022,31（5）:41-45.7 王建伟,张斌,孙振波,等.静电自组装法制备PHMB/-ZrP及 其 在 抗 菌 氨 纶 中 的 应 用 J.合 成 纤维,2021,50(12):5-10.8 XinghanChen,PengfeiTan,YaWen,WenchengZhou,YingCen,ChaoYou,LinTan,MengTian.FacileScalableOne-StepWet-spinningofSurgicalSutureswithShapeM