菊花明目方提取与干燥工艺及抗氧化活性研究_李俊博.pdf

收稿日期：；修订日期：基金项目：浙江省基础公益研究项目（）；作者简介：李俊博（），男（汉族），河南周口人，浙江中医药大学学生通讯作者简介：吴素香（），女（汉族），浙江金华人，浙江中医药大学教授，硕士研究生导师，博士学位，主要从事中药制剂研究工作菊花明目方提取与干燥工艺及抗氧化活性研究李俊博，周衡朴，张佳欢，吴素香（浙江中医药大学药学院，浙江 杭州）摘要：目的 优化菊花明目方提取、干燥工艺，研究其提取物体外抗氧化活性。方法 以绿原酸、木犀草苷转移率，出膏率为指标，在单因素试验的基础上结合正交试验优化醇提工艺；比较不同的干燥方法，通过吸湿曲线考察不同辅料对真空干燥效果的影响；并以抗坏血酸（）为阳性对照，采用、法对菊花明目方提取物体外抗氧化活性进行了研究。结果 最佳提取工艺为用 倍量体积分数 的乙醇，提取 次，每次提取 ，绿原酸与木犀草苷的转移率分别为 、，浸膏收得率为 ；选择 甘露糖醇辅助醇提物进行真空干燥；抗氧化活性研究表明，菊花明目方提取物对 自由基、自由基清除率分别可达（）、（）。结论 优选的提取、干燥工艺稳定，重现性良好。菊花明目方提取物具有良好的抗氧化作用。关键词：菊花明目方；提取；干燥；吸湿曲线；抗氧化活性 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，）：，：，（）（），：；视疲劳是现代常见的眼科疾病，主要由长期不良的用眼习惯导致，如长时间注视手机、电脑等电子产品，在光线不足的环境下视物，泪腺分泌不足等，。视疲劳常见症状为眼干、眼涩、视物不清、视力下降等，目前我国已有超过 亿的视疲劳患者。中医理论认为视疲劳主要是因肝肾不足和肝气郁滞所致，主要从补益肝肾、益精明目、排解肝郁等方面治疗。菊花明目方是眼科的临床经验方，由菊花、枸杞子、决明子、黄精中药组成，菊花疏散风热，平抑肝阳，清肝明目。决明子清热明目，润肠通便。枸杞子滋补肝肾，益精明目。黄精补气养阴，健脾，润肺，补肾 。用于肝肾阴虚之两目干涩，内障目昏等症，具有较好疗效。本实验优化了菊花明目方提取和干燥工艺，研究了菊花明目方提取物的体外抗氧化作用，为后期制剂制备及临床应用提供参考。材料与仪器 材材料料 杭白菊、决明子、枸杞子、黄精药材均购于浙江中医药大学饮片厂，经浙江中医药大学药学院陈孔荣教授鉴定分别为菊科植物菊 的干燥头状花序、豆科植物决明 的干燥成熟种子、茄科植物宁夏枸杞 的干燥成熟果实；绿原酸（，含 量 ）、木 犀 草 苷（，）、无水葡萄糖（，含量 ）购于成都曼思特生物科技有限公司；抗坏血酸购于北京伊诺凯生物科技 有 限 公 司；、自 由 基 清 除 能 力 试 剂 盒（）购于江苏艾迪生生物科技有限公司。乙腈、甲醇为色谱纯；其余试剂为化学分析纯。仪仪器器 高效液相色谱仪（四元梯度洗脱溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机，自动进样系统，检测器，色谱工作站）；色谱柱：，；贝克曼离心机（美国）；紫外可见分光光度计（日本 公司）；酶标仪（美国伯腾公司）。方法与结果 色色谱谱条条件件 色谱柱：（，）；流动相为乙腈（）磷酸（）溶液，流动相梯度见表；检测波长 ；柱温 ；进样量 。专专属属性性试试验验 对对照照品品溶溶液液制制备备 精密称取绿原酸对照品及木犀草苷对 时珍国医国药 年第 卷第 期照品，置棕色量瓶中，加甲醇制成浓度分别为 、的混合对照品溶液，备用。表 流动相梯度表时间 流速 流动相 流动相 供供试试品品溶溶液液制制备备 按处方比例称取饮片，置圆底烧瓶中，加入适量乙醇回流提取，滤过，合并滤液，精密量取 ，蒸干后用甲醇溶解并定容于 量瓶中，微孔滤膜过滤，备用。色谱图见图。阴阴性性对对照照溶溶液液制制备备 按处方比例称取除杭白菊外的其他饮片，按“供试品溶液制备方法”制成阴性对照液，备用。绿原酸 木犀草苷 对照品溶液；供试品溶液；阴性对照溶液图 菊花明目方 色谱图 标标准准曲曲线线建建立立 精密吸取混合对照品溶液、，分别置于 量瓶内，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成一系列浓度的混合对照品溶液：绿原酸 、；木犀草苷 、。按“”项下色谱条件分别进样，以对照品的浓度（）为横坐标，峰面积 为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。计算得绿原酸标准曲线方程为 ，木犀草苷标准曲线方程 ，结果表明，绿原酸在 范围内，木犀草苷在 范围内与峰面积呈良好的线性相关性。精精密密度度试试验验 取对照品溶液，连续进样 针，记录峰面积。绿原酸和木犀草苷峰面积 分别为 、，表明仪器精密度良好。稳稳定定性性试试验验 取供试品溶液适量，分别在、时进样，记录峰面积，计算含量。绿原酸和木犀草苷含量 分别为 、，说明样品在 内稳定性良好。重重复复性性试试验验 平行制备 份供试品样品，进样，记录峰面积，计算含量。绿原酸、木犀草苷含量 值分别为 、，说明该方法重复性良好。加加样样回回收收率率试试验验 精密称取 份已知含量的样品各 ，加入 量对照品，按“供试品溶液制备方法”制成供试品溶液，进样，记录峰面积，计算各成分加样回收率。绿原酸和木犀草苷的平均加样回收率分别为 、，分别为 、，说明该方法回收率良好。醇醇提提工工艺艺优优化化 提提取取方方法法 称取处方药材，加入适宜浓度的乙醇回流提取，滤过，合并滤液。提取液 减压浓缩至无醇味后，于真空干燥箱中 干燥至恒重。正正交交试试验验 以料液比（）、乙醇浓度（）、提取时间（）和提取次数（）为考察因素，以绿原酸和木犀草苷的转移率以及浸膏得率作为综合评价指标，综合评分 绿原酸 木犀草苷 浸膏得率 ，安排（）正交试验，因素水平见表。正交试验安排及结果见表，方差分析见表。表 正交试验因素水平水平 表 正交试验安排因素料液比乙醇浓度提取时间提取次数转移率 绿原酸木犀草苷浸膏得率 综合评分 均值 均值 均值 极差 表 方差分析结果因素偏差平方和自由度显著性料液比 乙醇浓度 提取时间 提取次数 误差 （，），直观分析结果表明：用 倍量 乙醇为提取溶剂，加热回流提取 次，每次 ，绿原酸和木犀草苷的转移率较高，各因素对提取结果的影响次序为料液比 提取次数 乙醇浓度 提取时间。方差分析均无显著影响，从节约时间和成本等综合考虑最后确定提取工艺条件为，即 倍量 乙醇，提取 次，每次 。验验 证证 试试 验验 称 取 处 方 药 材 份，按 最 佳 工 艺 条 件即 倍量 乙醇，提取 次，每次 进行提取，测定绿原酸及木犀草苷转移率，计算浸膏得率，结果见表。绿时珍国医国药 年第 卷第 期 原酸和木犀草苷的平均转移率分别为 、，平均浸膏得率为 ，结果表明优选的提取工艺所得绿原酸和木犀草苷转移率高，该工艺稳定可行，重现性较好。干干燥燥工工艺艺研研究究 不不同同干干燥燥方方法法的的考考察察 鼓鼓风风干干燥燥 取复方醇提液浓缩至稠浸膏状态（相对密度 左右），置 鼓风干燥箱内干燥至恒重。表 醇提验证试验结果（?）批次转移率 绿原酸木犀草苷浸膏得率 综合评分 平均 冷冷冻冻干干燥燥 取复方醇提液浓缩至稠浸膏状态（相对密度 左右），预冻 后冷冻干燥 。真真空空干干燥燥 取复方醇提液浓缩至稠浸膏状态（相对密度 左右），置 的真空干燥箱内，真空度控制在 ，干燥 。喷喷雾雾干干燥燥 取复方醇提液浓缩至无乙醇味，离心后取上清液进行喷雾干燥，进风温度 ，出风温度 ，喷速为。结结果果 鼓风干燥、真空干燥的样品均很粘稠。冷冻干燥的样品质地疏松，但由于醇提物吸湿性强，在取出后 内变得很黏。喷雾干燥的样品直接粘在样品罐的罐壁上。针对醇提物吸湿性强的特点，拟用抗吸湿性强的辅料来辅助提取物的干燥，并采用真空干燥继续下一步研究。醇醇提提物物真真空空干干燥燥工工艺艺研研究究 辅辅料料的的筛筛选选 由于复方醇提物的吸湿性强需选择适宜的辅料来降低它的吸湿性，参考相关文献 ，选择乳糖、环糊精（）以及 甘露糖醇三种辅料进行考察。乳糖常作为填充剂，无引湿性，性质稳定。包合提取物有抗吸湿效果。甘露糖醇具有引湿性低、性质较稳定的优点。真真空空干干燥燥工工艺艺样样品品的的制制备备 取复方醇提液浓缩至稠浸膏状态（相对密度为 左右），采用药（浸膏量）辅比：分别加入乳糖、及 甘露糖醇，混匀后置于 的真空干燥箱内，真空度控制在 ，干燥 。性性状状观观察察 观察干燥物的颜色，干燥程度等。溶溶解解性性考考察察 称取研成细粉的样品 ，置于 （）纯水中，每隔 强力振摇 ；观察 内的溶解情况。吸吸湿湿性性考考察察 吸湿性测定：将底部盛有氯化钠过饱和溶液的密闭干燥器于室温放置 ，使其内部达到湿度平衡，其相对湿度为 。取干燥的醇提物，置于恒重称量瓶中，准确称重后置于上述干燥器内。之后按时精密称定重量，计算吸湿率，并记录外观。吸湿率（）（吸湿后质量 吸湿前质量）吸湿前质量 。平衡吸湿率即为物料吸湿达到饱和时的吸湿率。吸湿曲线数据的二项式回归：中药的吸湿时间曲线和一元二次方程 （）的左半段比较相似，经对菊花明目方醇提物的吸湿时间曲线数据进行二项式回归处理，得到吸湿二项式方程 （为吸湿量，为时间，为常数）。对上述二项式方程进行一阶求导得吸湿速度方程 ，时可以得到吸湿初速度 ；接着对上述吸湿速度方程求导得吸湿加速度方程 。水水分分测测定定 取三批干燥提取物，利用水分测定仪分别进行水分测定。结结果果 各辅料辅助干燥醇提物的各项检查结果见表 ，图。由图 可得辅料为 环糊精、乳糖与 甘露糖醇的吸湿曲线形状基本一致，其平衡吸湿率为 甘露糖醇 乳糖 环糊精。对吸湿曲线进行二项式回归，结果发现各方程拟合良好。以平衡吸湿率为考察指标，从表 可以看出各辅料辅助干燥醇提物的吸湿程度是：甘露糖醇 乳糖 环糊精。从粉末外观来看，辅料为 环糊精和 甘露糖醇均为轻度结块，轻触即散，辅料为乳糖结块严重。表 真空干燥醇提物的性质辅料外观性状溶解性吸湿平衡后的外观含水量 无黑褐色（粘稠）环糊精棕色粉末混悬有沉淀棕色粉末（结块）乳糖棕褐色粉末（结块）基本溶解 棕褐色粉末（湿润结块）甘露糖醇棕褐色粉末基本溶解棕褐色粉末（结块）表 各辅料辅助干燥醇提物吸湿曲线拟合结果辅料名称吸湿方程吸湿速度方程 环糊精 乳糖 甘露糖醇 表 吸湿性能特征参数辅料名称吸湿初始速度 吸湿加速度 达到吸湿平衡时间 平衡吸湿率 环糊精 乳糖 甘露糖醇 图 干燥醇提物的吸湿曲线 干干燥燥后后醇醇提提物物的的粉粉体体学学特特性性考考察察 休休止止角角的的测测定定 采用固定高度法，将漏斗置于圆盘上方一定距离，把物料加入到漏斗中，物料从漏斗下口自由流出，使其逐渐堆积在圆盘上，形成锥体，测定锥体高 和底面圆盘半径 ，按下式计算休止角：松松密密度度与与振振实实密密度度的的测测定定 称取 待测粉末缓慢加入到 量筒中，轻轻抹平粉末表面，计算待测粉末的容积，求得松密度。然后将粉末压实，计算其容积从而得到振实密度。松密度 粉末质量 粉末容积振实密度 粉末质量 压实的粉末容积 结结果果 三种辅料辅助干燥的醇提物的流动性排序为：环糊精 乳糖、甘露糖醇。结果见表。考虑到粉体的流动性对颗粒剂的装量差异以及正常操作影响较大，因此综合所有实验结果以及后期制剂制备需要，最后确定用 甘露糖醇作为辅料辅助干燥醇提物，同时兼作矫味剂。菊菊花花明明目目方方提提取取物物的的体体外外抗抗氧氧化化研研究究 样品制备：提取物加水溶解配制成浓度为、的待测溶液。精密称取抗坏血酸 于量瓶中，使用蒸馏水定容，获得浓度为 的溶液，然后稀释成同待测溶液的系列浓度。时珍国医国药 年第 卷第 期表 干燥醇提物粉末特性指标（?）辅料休止角 松密度 振实密度 豪斯纳比（）环糊精 乳糖 甘露糖醇 对对 清清除除作作用用 参考文献方法并改进测定方法。以抗坏血酸为阳性对照，将 和 过硫酸钾等体积混合，在室温、黑暗条件下静置超过 ，形成 自由基储备液。使用前用 乙醇将其稀释成工作液，使其在 处的吸光度为（）。分别取不同浓度的待测溶液，加入 工作液，混合后在暗处静置 ，于 处测定吸光度。对照组用 乙醇替代样品。平行测定 次，计算清除率（）（），其中、分别代表样品组和对照组的吸光度值。由图 可知：菊花明目方提取物对 自由基有一定的清除作用，且在一定范围内质量浓度越大，清除 自由基能力越强。当提取物浓度为 时的清除率最高，