荆防颗粒抗感染性肺炎的靶点发现及分子机制研究_赵眉眉.pdf

年 月第 卷第 期.，.，收稿日期 基金项目 国家自然科学基金项目（，）；中央高校基本科研业务费项目通信作者曾克武，研究员，：；张贵民，研究员，：作者简介 赵眉眉，：荆防颗粒抗感染性肺炎的靶点发现及分子机制研究赵眉眉，姚璐，姚景春，孙成宏，张贵民，曾克武（北京大学 药学院 天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京；鲁南制药集团股份有限公司 中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂）摘要 基于靶点“钩钓”策略鉴定荆防颗粒发挥抗感染性肺炎的直接药理靶点群，基于靶点相关药理学信号通路探究荆防颗粒治疗感染性肺炎的分子机制。制备荆防颗粒药效成分键合的磁性微球，并与细菌脂多糖（，）诱导的小鼠肺炎组织裂解液进行孵育，通过高分辨质谱对捕获的蛋白进行分析，筛选与荆防颗粒提取物存在特异性结合的作用靶点群。利用京都基因与基因组百科全书（，）分析靶点蛋白群相关信号通路。在此基础上，进一步构建 诱导的小鼠感染性肺炎模型，通过苏木精伊红（，）染色、免疫组化染色等方法对靶点蛋白群可能的生物学功能进行验证。累计从肺组织中鉴定到 个荆防颗粒特异性结合的蛋白，基于 通路分析发现这些靶点蛋白作用的信号通路主要包括沙门菌感染、血管和肺上皮黏着连接、核糖体相关的病毒复制、病毒的内吞作用和脂肪酸降解相关信号通路；反映荆防颗粒的靶点功能主要与肺部炎症与免疫、肺能量代谢、肺微循环和病毒感染有关。最后，基于体内炎症模型发现，荆防颗粒显著改善 所致感染性肺炎模型小鼠的肺泡结构并下调炎症标志蛋白肿瘤坏死因子（）和 表达；上调线粒体功能关键蛋白细胞色素 氧化酶（）表达量及 含量；上调微循环相关蛋白 与 表达；上调病毒感染相关蛋白 与 表达，提示荆防颗粒能够抑制肺部炎症、改善肺部能量代谢和肺微循环、抵抗病毒感染，进而发挥肺保护作用。研究结果从靶点信号通路药理功效的角度系统诠释了荆防颗粒治疗呼吸系统炎症的分子药理机制，为其临床合理用药提供了数据支撑，并有助于拓展其新的药理学用途。关键词 肺炎；荆防颗粒；靶点鉴定；微循环；病毒感染 ，（，；，），（）（），（），（）年 月第 卷第 期.，.，（）（），；：.感染性肺炎是由支原体、细菌或病毒等病原微生物引起的肺部炎症，临床以发热、咳嗽、头痛等症状为主要表现，具有传染性。抗生素疗法是感染性肺炎的主要治疗手段，但其有效性不断受到耐药性菌株的威胁。而中医药治疗肺炎具有疗效明确、毒副作用小等优势，主要以“宣肺平喘、止咳化痰”为主。荆防颗粒传承荆防败毒散的原方，由荆芥、防风等药物组成。现代药理学研究表明其具有解热、镇痛和抗炎的功效。本研究基于课题组前期开发的中药复杂体系靶点“钩钓”策略，鉴定荆防颗粒拮抗肺部炎症的直接药理靶点，基于京都基因与 基 因 组 百 科 全 书（，）通路分析探索靶点相关药理学信号通路，并在小鼠体内炎症模型上探究了靶点群相关的药理功效，以期揭示荆防颗粒治疗感染性肺炎的分子药理机制。材料.动物 周龄的雄性 小鼠 只，体质量 ，购自北京大学医学部实验动物中心，许可证号（京），动物实验经北京大学生物医学伦理会批准（批准号）。动物房保持 光照 黑暗循环，温度 ，期间自由饮食、饮水。雄性 小鼠 只随机分为 组，适应性饲养 。.试剂与仪器 荆防颗粒浸膏（批号）和荆防颗粒挥发油（批号）由山东新时代药业有限公司供应，浸膏与挥发油以 混合后使用，保存。肿瘤坏死因子（，）抗体（批号）和白细胞分化抗原（，）抗体（批号）购自美国 公司；白细胞介素（，）抗体（批号）和 抗体（批号）购自英国 公司；细胞色素 氧化酶（，）抗体（批号）购自美国 公 司；死 亡 盒 解 旋 酶 （，）抗体（批号）和死亡盒解旋酶（，）抗体（批号）购自美国 公司；免疫组化染色试剂盒（批号）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；氯化钠注射液（批号）购自石家庄四药有限公司；苯胺蓝染液（货号）购自北京中科万邦生物科技有限公司；丽春红染液（货号）、铁苏木素染液（货号）、磷钼酸染液（货号）、显色剂和中性树胶封片剂购自北京中科万邦生物科技有限公司；增强型三磷酸腺苷（）检测试剂盒（货号）购自北京碧云天生物科技有限公司。组 织 匀 浆 仪 购 自 美 国 公司；台式冷冻离心机购自德国 公司；电子天平购自德国 公司；多功能酶标仪购自美国 公司；场发射扫描电子显微镜购自德国 公司；离子阱串联质谱赵眉眉等：荆防颗粒抗感染性肺炎的靶点发现及分子机制研究购自美国 公司；脱水机和 包埋机购自武汉俊杰电子有限公司；病理切片机购自德国 公司；组织摊片机购自浙江省金华市科迪仪器设备有限公司；烤片机购自常州国华电器有限公司；摇床购自美国赛洛捷克公司；数字化全景扫描仪购自江苏智跃医疗科技有限公司。方法.荆防颗粒键合微球的制备将 溶于乙二醇，同时加入柠檬酸钠和醋酸钠，溶解后置于高压反应釜中，设置温度为 ，反应 ，合成空白磁性微球。通过与二巯基丁二酸（）在 恒温孵育 ，在其表面修饰巯基。再加入 赖氨酸三异氰酸酯（）将已修饰巯基的磁性微球和二苯甲酮进行连接，即完成表面化学物的修饰。取已化学修饰成功的磁性微球 分散于 甲醇溶液，准确称量 荆防颗粒浸膏溶解于上述体系，将反应体系置于反应器中，紫外照射 后，用 替换溶剂，得到键合荆防颗粒的磁性微球并保存备用。.荆防颗粒靶点蛋白的捕获 利用 诱导的小鼠肺组织蛋白裂解液作为靶点蛋白库，设置空白组、结合组和竞争组，每组 个重复。空白组为未键合药物成分的空白磁性微球与蛋白裂解液 孵育过夜；结合组为键合荆防颗粒的磁性微球与蛋白裂解液 孵育过夜；竞争组先将蛋白裂解液与 荆防颗粒 孵育 ，再加入键合荆防颗粒的磁性微球 孵育过夜。次日利用配有.的 溶液进行洗脱，最后将磁珠分散在 溶液中备用。.基于高分辨质谱（）鉴定靶点蛋白 以 流速上样，再用 流速洗脱至分析柱中进行分离。色谱条件设置为流动相 为.甲酸水溶液，流动相 为.的乙腈溶液，梯度洗脱（，；，；，）。串联质谱采用线性离子阱静电场轨道阱质谱仪（），一级质谱采用 检测，分辨率 处为 ；采集质量范围 ，依次选取一级质谱中离子强度最强的 个离子进行 二级串联质谱分析。数据采用.进行定量分析。数据库为 小鼠源库；蛋白酶为胰蛋白酶；固定修饰为半胱氨酸的烷基化（，.），可变修饰为甲硫氨酸的氧化（，.）；选择 （）；其他参数均为默认值。对高分辨质谱鉴定的蛋白结果进行数据分析，通过筛选（结合组质谱强度空白组质谱强度）（竞争组质谱强度空白组质谱强度）.的蛋白，进一步通过对（结合组质谱强度空白组质谱强度）与（竞争组质谱强度空白组质谱强度）进行组内 检验（.），筛选与荆防颗粒存在特异性结合作用的靶点蛋白。将筛选得到的蛋白结果导入 软件，将（）设置为 轴，点击 插件，将 设置为.，设置为，进行数据分析。.基于 数据库分析靶点蛋白功能将差异蛋白导入 .软件，应用其中的 插件进行 分析，设置种属为小鼠，阈值为.。其余均采用默认参数。.细菌脂多糖（）诱导的 小鼠炎症模型 只 小鼠，雄性，体质量 ，随机分为空白组、模型组以及荆防颗粒低剂量组（）、高剂量组（），共 组，每组 只。灌胃给药，连续 后，模型组以及荆防颗粒低、高剂量组每只小鼠腹腔注射 的 溶液（）造模。后小鼠麻醉后断脊处死，取出肺组织，用生理盐水清洗后留用。.免疫组化分析将肺组织置于 多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，切片后用二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，清洗 次，置于柠檬酸缓冲液进行抗原修复，孵育 ；弃去柠檬酸缓冲液，加入 孵育 。弃去，清洗 次，室温封闭 。弃去封闭液，清洗 次，加入相应 的抗体稀释液，孵育过夜。清洗切片 次，加入山羊抗兔 稀释液室温孵育 。清洗 次，滴加二氨基联苯胺（）显色液于切片上，室温孵育 。清洗 次，然后用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。通过数字病理切片扫描仪进行拍照，软件统计空白组、模型组以及荆防颗粒低、高剂量组的肺组织相关蛋白表达水平。.苏木精伊红（）染色取出切好的石蜡切片，苏木精染色 ；清洗 次；乙醇分 年 月第 卷第 期.，.，化 ；清洗 次；放入 的温水中返蓝，直到出现蓝色为止。清洗 次；伊红染色 ；清洗 次；梯度乙醇脱水后，二甲苯透明，中性树胶封片。使用光学显微镜观察炎性细胞浸润情况，在 倍镜下拍摄照片留存。结果.荆防颗粒作用于肺炎组织的直接靶点群鉴定 本实验首先基于二苯甲酮（）的光交联特性，将荆防颗粒提取物偶联至磁性纳米微球表面，制备荆防颗粒全成分键合的磁性微球。进而利用该微球从小鼠肺炎组织裂解液中直接捕获荆防颗粒的直接作用靶点群。借助磁力架收集微球并对非特异结合的蛋白进行洗脱，最后将微球上特异结合的蛋白进行酶解消化为肽段，通过高分辨质谱对捕获的靶点蛋白进行鉴定（图）。通过透射电镜观察磁性微球的形貌，发现磁性微球的分散性较好、粒径较为均一；键合荆防颗粒粗提物后，可见明显的“核（纳米）壳（修饰的荆防颗粒提取物）”型结构（图）。利用荆防颗粒提取物键合的磁性微球，本研究从肺组织裂解液中累计鉴定到 个潜在结合靶点，通过结合特异性分析，以 和.为显著性界限进行数据筛选，最终得到 个荆防颗粒提取物特异性结合的靶点蛋白（图）。靶点“钩钓”流程示意图（荆防颗粒提取物键合的微球）；空白磁性微球（左）、键合荆防颗粒全成分的磁性微球（右）透射电镜图；荆防颗粒作用于肺炎组织的靶点蛋白火山图。图 荆防颗粒作用于小鼠肺炎组织的直接靶点群鉴定 .荆防颗粒作用于肺炎组织的靶点网络分析选取荆防颗粒作用于肺组织的 个特异性结合靶点蛋白，以生物信息学进行 通路富集分析（图）。结果发现，这些靶点蛋白主要与如下信号通路或疾病相关：沙门菌感染、血管和肺上皮黏着连接、核糖体相关的病毒复制、病毒的内吞作用和脂肪酸降解相关信号通路。沙门菌感染会通过非经典焦亡途径引发炎症反应，由此推测荆防颗粒可通过调控焦亡相关信号通路发挥抗炎作用；黏着连接通常与炎症造成的血管和肺上皮通透性增加相关，由此推测荆防颗粒可能通过影响黏附分子抑制肺组织炎性渗出及肺水肿，起到抗肺炎作用；核糖体，病毒需要利用宿主细胞的核糖体来合成其蛋白质外壳，从而大量翻译复制，感染上呼吸道，引发病毒性肺炎，由此推测荆防颗粒可能靶向病毒复制必需的蛋白 核糖体蛋白而抑制病毒 翻译及复制过程，有助于机体抵抗病毒性肺炎；内吞作用，大多数病毒通过内吞作用进入宿主细胞，由此推测荆防颗粒可能会影响病毒的内吞作用，拮抗病毒对肺部的侵袭；脂肪酸降解，脂肪酸赵眉眉等：荆防颗粒抗感染性肺炎的靶点发现及分子机制研究是机体主要供能物质之一，且脂肪酸代谢产物广泛参与细胞能量代谢调控，因此推测荆防颗粒调控了脂肪酸降解途径，进而改善肺组织能量代谢，为呼吸肌提供能量。图 荆防颗粒作用于肺炎组织的靶点蛋白 通路分析 .荆防颗粒抑制 诱导的小鼠肺部炎症损伤 肺部的免疫状态对于机体抵抗病原体入侵具有重要作用，因此肺部炎症的调节和正常免疫功能的维持对于机体抵抗病原微生物具有重要意义。首先通过 染色考察了荆防颗粒对肺泡结构的影响，发现空白组小鼠肺泡结构比较完整，肺泡间隔薄，肺泡腔内无炎性渗出物；模型组小鼠肺炎组织病理改变明显，肺泡正常结构消失，肺泡腔出现大量炎症细胞浸润，肺泡间隔充血增厚；荆防颗粒作用后，低剂量组肺组织病理状况较模型组有一定程度改善，特别是高剂量组小鼠肺泡结构比较完整，组织结构清晰（图），提示荆防颗粒具有较为显著的肺损伤保护作用。进一步，本研究通过免疫组化染色考察了荆防颗粒对炎症标志蛋白 和 表达的影响，发现 显著诱导肺部炎症因子 和 的表达，而荆防颗粒显著降低了小鼠肺组织中 和 的表达（图），显示出良好的抗感染性肺炎作用。.荆防颗粒改善小鼠肺炎组织能量代谢现代医学认为当肺部呼吸肌肉群动力不足时，肺部的气体交换、血液循环，乃至营养和废物的代谢均会显著减弱，进而影响整个人体的能量代谢及生命活动进程，同时肺部动力不足及呼吸功能减弱也是中医理论中所指的肺气虚的典型特征与临床表现。前期通过靶点网络功能分析，推测荆防颗粒是部分通过脂肪酸降解等信号通路影响肺组织能量代谢，进而发挥肺组织保护作用的。线粒体是细胞的能量工厂，线粒体能量代谢途径的异常与肺损伤的发生 年 月第 卷第 期.，.，染色