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壳聚糖通过下调动静脉内瘘模型家兔血清 MCP-1 和 VEGF-A 表达影响血管内膜增生作用机制郑婕李小生彭凤罗娟汤显湖(赣南医学院第一附属医院，江西赣州341000)摘要 目的探讨壳聚糖下调动静脉内瘘模型家兔血清单核细胞趋化蛋白(MCP)-1 和血管内皮生长因子(VEGF)-A 表达影响动脉内膜增生的作用机制。方法选取新西兰兔 60 只作为实验对象，48 只用于建立动静脉内瘘模型，分为模型对照组和壳聚糖低、中、高剂量组，每组 12 只，雌雄各半，其余 12 只行假伤手术作为假伤对照组。壳聚糖低、中、高剂量组脉注射不同剂量的壳聚糖溶液，假伤对照组和模型对照组注射等量的生理盐水，治疗 28 d 后观察相关指标。苏木素-伊红(HE)染色观察实验兔颈内静脉内膜病理变化，测量并计算各组新生血管内膜厚度，免疫组化法检测血管内膜组织 MCP-1、VEGF-A 表达水平，Western 印迹检测实验兔血清 MCP-1、VEGF-A 蛋白表达水平，qT-聚合酶链反应(PC)检测血清 MCP-1 mNA、VEGF-A mNA 表达水平。结果各组血管内膜组织 MCP-1 和 VEGF-A 蛋白阳性表达、血清 MCP-1 和 VEGF-A 蛋白相对表达量、血清 MCP-1 mNA 和 VEGF-A mNA 相对表达量及新生动脉内膜厚度差异均有统计学意义(P0.05)。上述 7 个指标水平中，与假伤对照组比较，建模各组均明显升高，模型对照组均明显高于壳聚糖低、中、高剂量组，壳聚糖低剂量组明显高于中、高剂量组(P0.05);除 MCP-1 mNA 和 VEGF-A mNA 外，其余指标水平在壳聚糖中剂量中均明显高于高剂量组(P0.05)。HE 染色结果显示，建模各组可见内膜增生，血管管腔明显变窄，壳聚糖干预治疗各组，增生内膜减少，剂量越大抑制内膜增生越明显。Pearson 相关性分析显示，血清 MCP-1、VEGF-A 蛋白及其 mNA 相对表达量与新生血管内膜厚度呈正相关(r=0.830，0.840，0.818，0.828;P=0.000)。结论壳聚糖可有效下调动静脉内瘘模型内膜组织及血清 MCP-1 和 VEGF-A 表达，抑制动脉内膜增生作用。关键词 壳聚糖;动静脉内瘘模型;单核细胞趋化蛋白-1;血管内皮生长因子-A;血管内膜增生中图分类号 332 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0633-05;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.033基金项目:江西省卫生计生委科技计划项目(No20185333)通信作者:李小生(1980-)，男，硕士，副主任医师，主要从事慢性肾脏病、血管通路及腹膜透析研究。第一作者:郑婕(1987-)，女，硕士，主治医师，主要从事肾内科研究。慢性肾脏病(CKD)发病率逐年增加，我国 CKD患病率为 10.8%，发病率高达 5%左右1，而 CKD引起的尿毒症已严重威胁患者生命健康2。血液透析是 CKD 引起的尿毒症有效疗法，在临床中得以广泛应用，而正确有效的血管通路选择关乎患者生命健康。自体动静脉内瘘具有通畅率高、并发症少、手术操作、简便及医疗费用较低等优点，因此首选用于血液透析治疗，并且自体动静脉内瘘是血液透析的主要血管通路形势，由于血管内膜增生作用，自体动静脉内瘘的容易出现通畅率下降和血管通路并发症现象，大大降低了其使用寿命及增加了血管功能障碍，因此临床探讨药物抑制血管内膜增生具有重要的意义。壳聚糖又名为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D 葡萄糖，是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到，在医药、食品、化工等诸领域中的应用研究取得了重大进展3 5，研究证实壳聚糖不仅具有降血脂、降血糖的作用6，7，也被证实与新生血管形成相关。研究显示单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、血管内皮生长因子(VEGF)-A 蛋白与血管内膜形成相关8，本研究观察壳聚糖影响动静脉内瘘模型家兔血清 MCP-1 和 VEGF-A 变化水平，探讨其抑制血管内膜增生作用机制。1材料与方法1.1实验动物成年健康新西兰兔 60 只，雌雄各半，体重(2 50050)g，购自实验动物中心，本研究通过动物伦理委员会批准，符合伦理要求。1.2主要试剂与仪器主要试剂:壳聚糖批准文号:粤 食 药 监 械(准)字 2019 第 1413247 号，30 ml/瓶 购自广州润虹医药科技有限公司，12%水合氯醛购自青岛青尔源药业有限公司，4%甲醛和10%甲醛购自聊城芫泽化工产品有限公司，石蜡、伊红染液、苏木素染液均购自甘肃隆鑫商贸有限公司，磷酸盐缓冲液(PBS)和 TUNEL 试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司。总 NA 提取试试剂盒和聚合酶链反应(PC)试剂盒购自 Promega 公司，PC 引物由上海达科为生物技术公司合成，GAPDH 购自中杉金桥生物技术有限公司。兔抗大鼠 MCP-1 一抗(批号:sc-190328)和兔抗大鼠 VEGF-A 一抗(批号:sc-135471)均购自美国 Santa Cruz 公336郑婕等壳聚糖通过下调动静脉内瘘模型家兔血清 MCP-1 和 VEGF-A 表达影响血管内膜增生作用机制第 3 期司。主要仪器:普通外科手术器械属上海金钟手术器械厂有限公司产品，光学显微镜属日本 OLYMPUS公司产品，紫外分光光度计购自上海光谱仪器有限公司，酶标仪属 Thermo multiskan MK3 公司产品，实时荧光定量 PC 仪属 Applied Biosystems 产品，高速离心机属德国 Eppendorf 公司产品，电泳仪和凝胶成像系统属美国 Bio-ad 公司产品。1.3动静脉内瘘模型建立将 60 只新西兰兔进行雌、雄分类后，随机从中分别选取雌、雄各选 24 只新西兰兔建立动静脉内瘘模型，参照文献动静脉内瘘模型建立方法9。经兔耳缘静脉注射 12%水合氯醛进行麻醉，剪开颈部皮毛，在无菌操作环境下沿下颌角与锁骨中点连线切开皮肤长约 3 cm，分离皮下组织及游离左颈动、静脉，结扎颈内静脉远端，剪断，应用无创血管阻断钳阻断颈动脉近端和远端血流，用手术刀沿颈动脉长轴切口 0.5 cm 切口，再行颈内静脉与颈动脉端侧吻合。动静脉内瘘模型判定:去除动、静脉两端无创血管阻断钳恢复循环后，近端颈静脉立即充盈，可触及明显的搏动和震颤，提示颈动静脉吻合成功。另取 12 只新西兰兔也进行相关手术用于假伤对照，除动静脉吻合的操作步骤外，其余步骤与动静脉内瘘模型建立一致。1.4实验兔治疗及分组参考临床壳聚糖使用剂量(120 g/ml)10，按 照 体 重(兔:2.5 kg，人:50 kg)折 算 后，计 算 兔 适 宜 剂 量(中 剂 量)为5 g/ml，设置低剂量和高剂量分别为 1 g/ml 和25 g/ml。将假伤对照的 12 只新西兰兔作为假伤对照组，动静脉内瘘模型随机分成模型对照组、壳聚糖低、中、高剂量组，每组 12 只，雌雄各半。壳聚糖低、中、高剂量组分别在术后将壳聚糖涂抹在动静脉内瘘血管上，假伤对照组和模型对照组术后涂抹生理盐水，观察 28 d 后相关指标变化情况。1.5苏木素-伊红(HE)染色观察血管内膜病理变化壳聚糖治疗 28 d 后，抽取各组兔血液保存备用，随机处死各组兔子，在无菌操作台中剪取左颈颈内静脉段(近端，距离动静脉瘘口约 1 cm 内)用于血管内膜病理学观察，以 4%甲醛固定，石蜡包埋后制作约 5 m 厚的病理组织切片，HE 染色后在光镜下(400 倍)观察静脉内膜病理变化，选择清晰视野进行拍照，采用 Image Pro Plus6.0 软件对图片进行分析，测量各组实验兔血管内膜厚度，计算各模型组新生血管内膜厚度，新生血管内膜厚度=实际测量血管内膜厚度假伤对照组血管内膜厚度均值。1.6免疫组化法检测血管内膜组织 MCP-1 和VEGF-A 表达水平制作切片:剪取左颈内静脉段(近端，距离动静脉瘘口约 1 cm 内)组织，用 12%甲醛固定液固定，48 h 后用 PBS 洗涤，脱水后浸蜡，包埋机上进行包埋，制作标本切片。免疫组化染色:烤片脱蜡，水化后高压修复 15 min，在湿盒中加入 3%H2O2孵育 12 min，加入鼠抗兔 MCP-1、VEGF-A 抗体 4过夜孵育，滴加二抗室温再孵育 25 min，加入DAB 显色剂，标本切片用苏木素染色 3 min，再用1%盐酸乙醇分化透明，在光镜(200 倍)视野下进行观察，用 Lecia Applaction Stiue 图像分析系统进行分析，阳性表达计 2 分，阴性表达计 1 分，分值越高代表阳性表达越高。1.7Western 印 迹 检 测 实 验 兔 血 清 MCP-1 和VEGF-A 表达水平抽取各组实验兔血液 5 ml，放入离心管中，室温下 3 000 r/min 离心 12 min，静置后收集上清液，提取血清总蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒对提取的总蛋白进行定量，按比例加入 4蛋白上样缓冲液，95变性 5 min，置于20保存备用。设置浓缩胶电压为 80 V，分离胶电压为 120 V 进行 SDS-PAGE 电泳，转印。取聚偏氟乙烯(PVDF)膜用 TBST 洗膜 5 min，共 3 次，加入 2%膜封闭液(BSATBS)配制封闭液中进行封闭，室温摇床孵育 2 h。洗膜后先后加入一抗工作液(MCP-1 抗体和 VEGF-A 抗体)和二抗工作液，进行一抗孵育和二抗孵育。将新鲜配制的电化学发光(ECL)液滴加到 PVDF 膜表面，转移至成像分析系统暗箱中曝光，采集图像并分析。蛋白定量:以相对光密度值代表蛋白相对表达量，以 GAPDH 为内参进行分析，实验至少重复 3 次。1.8qT-PC 检测血清 MCP-1 mNA 和 VEGF-AmNA 表达水平抽取各组实验兔血液 5 ml，放入离心管中，室温下 3 000 r/min 离心 12 min，静置后收集上清液，采用 Trizol 法提取血清总 NA，按照PC 逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，PC 引物为:MCP-1:上游:5-AATGGGTCCAGAAGTAC-3，下 游:5-TCAGATTTATGGGTCAA-3;VEGF-A:上游:5-TTGCTGCTACCTCCAC-3，下 游:5-AATGCTTTCTCCGCTCTG-3;GAPDH:上 游:5-GAAGGT-GAAGGTCGGAGT-3，下游:5-GAAGATGGTGATGG-GATTTC-3。设置好 qT-PC 体系，设置反应条件:95 5 min，95 30 s，55 30 s，72 35 s，共40 个循环。以 2Ct计算相应 mNA 的相对表达量。1.9统计学方法采用 SPSS22.0 软件进行单因素方差分析、LSD 检验、Pearson 相关性分析。436中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷2结果2.1壳聚糖治疗实验兔血管内膜组织 MCP-1 和VEGF-A 蛋白表达影响免疫组化检测结果显示，各组血管内膜组织 MCP-1、VEGF-A 蛋白阳性表达差异具有统计学意义(P0.05)。与假伤对照组比较，建模各组 MCP-1、VEGF-A 蛋白阳性表达明显升高，模型对照组 MCP-1、VEGF-A 蛋白阳性表达明显高于壳聚糖低、中、高剂量组，壳聚糖低剂量组明显高于中、高剂量组，且壳聚糖中剂量明显高于高剂量组(均 P0.05)。见图 1、表 1。2.2壳聚糖治疗实验兔对血清 MCP-1 和 VEGF-A蛋白和 mNA 的影响各组血清 MCP-1、VEGF-A蛋白和 mNA 相对表达量差异具有统计学意义(P0.05)。与假伤对照组比 较，建 模 各 组 MCP-1、VEGF-A 蛋白和 mNA 相对表达量明显升高，模型对照组 MCP-1、VEGF-A 蛋白和 mNA 相对表达量明显高于壳聚糖低、中、高剂量组，壳聚糖低剂量组明显高于中、高剂量组，且壳聚糖中剂量明显高于高剂量组(均 P0.05)。见表 1、图 2。图 1假伤对照组血管内膜组织 MCP-1 蛋白和 V