壳寡糖调节db_db小鼠糖脂异常和抗氧化作用_程沁园.pdf

壳寡糖调节 db/db 小鼠糖脂异常和抗氧化作用程沁园马明严琳吴小瑜(无锡卫生高等职业技术学校，江苏无锡214111)摘要 目的探究壳寡糖(COS)延缓 db/db 小鼠自发性糖尿病进程的可能机制，研究不同剂量 COS 对其糖脂异常的影响及抗氧化作用。方法自发性糖尿病 db/db 小鼠随机分为 4 组，每组 10 只，其中对照(Control)组按体重每日灌胃生理盐水(10 ml/kg);COS 低、中、高剂量(COS-L、COS-M、COS-H)组每日称重后按 250、500、1 000 mg/kg 体重剂量灌胃 COS 溶液。连续灌胃 16 w 后，测定小鼠血糖、糖原、血脂和抗氧化等指标，并对各脏器进行组织学检查。结果与 Control 组比较，COS 各组进入糖尿病前期和糖尿病阶段的时间均有一定的延后;COS 各组肝糖原和肌糖原含量显著提高(P0.01);COS 各组血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)明显降低(P0.01，P0.05);COS 各组肝组织内超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)比活力有所提高，尤其是 COS-M 组和 COS-H 组明显提高，丙二醛(MDA)含量显著降低(均 P0.01);组织学检查显示，COS 对胰腺和肾脏组织具有一定的保护作用。结论COS 可通过控制 db/db 小鼠血糖升高、减少糖原分解、调节血脂异常、抵抗体内氧化应激、保护组织等途径延缓糖尿病发生发展的进程。关键词 壳寡糖;血糖;血脂;抗氧化;糖尿病前期中图分类号 285.5 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0628-05;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.032基金项目:江苏省高校 青蓝工程 中青年学术带头人培养项目(苏教 2019 3 号);江苏省卫生职业技术教育研究课题(J201715)通信作者:吴小瑜(1982-)，女，硕士，讲师，主要从事多糖类活性物质研究。第一作者:程沁园(1981-)，女，博士，副教授，主要从事多糖类活性物质研究。糖尿病是我国老年人群中的高发性疾病之一，是由于胰岛素生成缺陷或(和)作用缺陷而引起的血糖水平超高1，其中 90%以上均为 2 型糖尿病。其发病机制尚未完全探明，主要与遗传因素、环境、生活方式与免疫等因素密切相关2。db/db 小鼠属遗传性肥胖 2 型糖尿病动物模型，其发病与瘦素基因有关，可用于 2 型糖尿病血脂紊乱的研究和抗糖尿病物质的筛选3。糖尿病前期是介于糖代谢正常与糖尿病之间的一个状态，包括空腹血糖受损(IFG)和糖耐量受损(IGT)，我国 20 岁以上人群中糖尿病前期比例高达 15.5%4。糖尿病前期不是一种疾病，而是一种不稳定的状态，既可以进一步发展为显性糖尿病，也可通过适当的干预措施而恢复正常或延长此过渡期5，对该人群进行早期干预，可使 2 型糖尿病发病危险降低 58%4，因此选择合适化合物对其进行干预具有重要的研究意义。壳聚糖是来源于甲壳类动物的一种线性多糖，其部分水解产物壳寡糖(COS)具有与其类似的生物活性，如抗菌、降低胆固醇、抗肿瘤等6 12。COS 曾被报道具有降血糖作用13 15，临床试验表明，COS 显著改善了血糖水平、糖化血红蛋白、促炎细胞因子及脂联素水平16。然而，由于 COS 活性受分子量和脱乙酰度等性质的影响较大，各研究结论并不一致。同时关于 COS 在糖尿病前期的影响研究较少，一般都是出现血糖异常后才开始服用 COS，对于其是否能预防或延缓糖尿病前期向糖尿病发展的作用有待研究。本文以 db/db 小鼠为自发性 2 型糖尿病模型动物，在其血糖尚未异常时给予不同剂量 COS，探索COS 在糖尿病前期和糖尿病发生、发展过程中对血糖异常、血脂异常和体内氧化应激等过程的影响。1材料与方法1.1实验动物自发性糖尿病 db/db 小鼠 40 只SPF 标准，许可证号:SCXK(苏)2016-0010，雄性，4 周龄，体重(24.02.0)g，购于常州卡文斯实验动物有限公司，稳定饲养 1 w 以适应环境。1.2试剂及设备COS(Mw=1 000 Da)，购自浙江金壳药业股份有限公司，生产批号 M-KG-1809001。正置显微镜:NIKON 公司，型号 ECLIPSE Ni;石蜡切片机:湖北徕克医疗仪器有限公司，型号 SQ2125;摊片机:湖北徕克医疗仪器有限公司，型号 PPTHK-21B;显微图像分析系统:NIKON 公司，型号 DS-i2;血糖测定仪:江苏鱼跃医疗设备股份有限公司，型号306 悦准型;血糖试纸:江苏鱼跃医疗设备股份有限公司，生产批号 380224;糖原、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、总蛋白定量测试盒:均为南京建成生物工程研究所;苏826中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷木素染液，珠海贝索(BASO)生物技术有限公司，货号 714094;伊红染液，珠海贝索(BASO)生物技术有限公司，货号 BA4099;其余试剂均为国产分析纯。1.3动物分组及受试物剂量小鼠随机分为 4 组，每组 10 只，其中对照(Control)组按体重每日灌胃生理盐水(10 ml/kg);COS 低、中、高剂量(COS-L、COS-M、COS-H)组每日称重后按250、500、1 000 mg/kg体重剂量灌胃 COS 溶液。连续给药 16 w，各组均自由进食饮水。1.4指标观察(1)每日给药后观察各组小鼠的一般状况并记录。(2)血糖测定17:每周测定 1 次空腹血糖(FBG)。提前禁食 8 h，取小鼠尾尖血约5 l，用血糖仪测定即得 FBG。(3)口服糖耐量测定(OGTT)18:每 4 w 测定 1 次。提前禁食 8 h，每组按体重灌胃 250 mg/kg 葡萄糖，分别于 0.0、0.5、1.0、2.0 h 取尾尖血测定餐后血糖值(PG)，计算曲线下面积(AUC)。(4)糖尿病病程判断:根据 2012年世界卫生组织(WHO)诊疗标准13，db/db 小鼠FBG 7.0 mmol/L 或 OGTT 试 验 中 2 h PG 11.1 mmol/L时即为糖尿病;6.1 mmol/LFBG 7.0 mmol/L且 OGTT 试验中 2 h PG7.8 mmol/L 时为 IFG 阶段;7.8 mmol/LOGTT 试验中 2 h PG11.1 mmol/L且 FBG7.0 mmol/L 时为 IGT 阶段。(5)血脂指标检测:给药周期结束后采血，按测试盒说明书操作测定 TC、TG、HDL-C、LDL-C 等各项指标。(6)肝糖原和肌糖原测定:给药周期结束后断颈处死 db/db 小鼠，取其肝脏和右后肢股直肌，用生理盐水清洗干净后按照测试盒说明书进行测定。(7)肝脏抗氧化指标检测:取 db/db 小鼠部分肝脏，用生理盐水清洗干净后吸干表面，按照测试盒说明书操作测定总蛋白、SOD、GSH-Px、MDA 等各项指标。(8)器官系数及组织学检查:db/db 小鼠处死后立即剖取胰腺、肝、脾、肾等器官，生理盐水清洗干净后吸干表面，称重计算器官系数(器官重量与小鼠体重之比)。各器官作组织切片，苏木素-伊红(HE)染色法观察其组织学变化。1.5统计学处理采用 SPSS13.0 软件进行 t检验。2结果2.1COS 对血糖的影响Control 组 db/db 小鼠FBG 上升很快，第 1 周即已超过 6.1 mmol/L，进入IFG 阶段;第 3 周已超过 7.0 mmol/L，进入糖尿病阶段，病程发展较为迅速。COS 对 FBG 控制见效快，摄入 1 w 后即可显著降低 FBG(P0.05)，至第 3 4 周时各剂量均已可显著降低 FBG(P0.01);至第16 周时，COS-L、COS-M、COS-H 各组 FBG 分别较对照组降低了 40.89%、39.27%和 51.01%。见表 1。表 1摄入 COS 对各组 FBG 的影响(xs，mmol/L，n=10)组别0 w1 w2 w3 w4 w5 w6 w7 w8 wControl 组5 30 461047 72 5983 710 42813 028167711685817 94 7COS-L 组5 30 75 50 61)6 20 967071)71082)91212)93292)92232)9 9392)COS-M 组5 40 45 40 71)59051)61052)65082)78162)87222)94232)9 3252)COS-H 组5 30 55 50 61)5 90 962052)67112)77182)89202)89212)9 0222)组别9 w10 w11 w12 w13 w14 w15 w16 wControl 组196431952 720 14 02113 62165 4230362314 524751COS-L 组1113 12)121382)12 6282)125312)133222)13 9182)137252)14 62 32)COS-M 组1072 22)120302)12 8222)138402)135322)13 5302)141232)15 02 32)COS-H 组94182)962 52)8 92 42)105282)111222)12 2342)116342)12 13 62)与 Control 组比较:1)P005，2)P0 012.2摄入 COS 对各组 OGTT 实验中 AUC 的影响COS 降低 AUC 的作用十分迅速且显著，自第 4 周起各 COS 组的 AUC 即显著低于 Control 组(P0.01);至试验结束时，COS 各剂量组 AUC 分别较对照组降低了 20.55%、19.53%和 20.87%，即该作用无剂量依赖性。见表 2。2.3COS 对各组 db/db 小鼠自发性 2 型糖尿病发展进程的影响Control 组平均进入 IFG 阶段的时间是在试验第 1 周，进入 IGT 阶段并发展为糖尿病的速度较快，第 2 周已进入糖尿病阶段;COS 各组进入糖尿病前期和糖尿病阶段的时间均有一定的延后，但均在第 2 3 周进入 IFG 阶段，在第 5 6 周时进入糖尿病阶段。COS 对延长 db/db 小鼠 IGT 阶段的效果较好，尤其是在 COS-H 组中 db/db 小鼠进入IGT 阶段的时间被延长至第 6 周。摄入低、中、高剂量的 COS 可延长 db/db 小鼠处于糖尿病前期的时926程沁园等壳寡糖调节 db/db 小鼠糖脂异常和抗氧化作用第 3 期间，使其进入糖尿病阶段的时间分别延长至第 4 周、第 5 周和第 5 周(Control 组为第 2 周)，即可延缓db/db 小鼠的自发性 2 型糖尿病的发展进程。见表 3。表 2摄入 COS 对 AUC 的影响(xs，hmmol/L，n=10)组别0 w4 w8 w12 w16 wControl 组49.137.0276.5611.60102.739.72106.687.47108.9914.05COS-L 组47.5410.0158.698.521)77.648.161)83.459.101)86.5910.051)COS-M 组46.559.7353.657.771)63.305.361)76.704.811)87.708.271)COS-H 组46.125.6553.066.561)63.698.641)75.728.681)86.248.491)与 Control 组比较:1)P0.01;表 5 同2.4COS 对肝糖原和肌糖原的影响与 Control 组相比，各剂量 COS 组均可显著地提高肝脏和肌肉中糖原的含量，且具有剂量依赖性(均 P0.05)。见表 4。2.5COS 对血脂的影响与 Control 组比较