抗抑制素α纳米抗体真核表达载体的构建_贾昊天.pdf

16xperimental study on onlineE实验研究抗抑制素 纳米抗体真核表达载体的构建贾昊天，马继福，吾热力哈孜哈孜汗（石河子大学动物科技学院 832000）摘要：为探究抗抑制素 纳米抗体在动物繁殖方面的功能，本实验使用本实验室筛选出的高特异性抗抑制素 纳米抗体（Nb4）基因，对其进行真核表达载体的构建，以期能为解决普通抑制素 免疫制剂产量不足和免疫原性较差的问题，更希望为提高绵羊繁殖力做出贡献。关键词：纳米抗体；抑制素 ；真核表达抑制素主要是由性腺所分泌的一种糖蛋白激素，抑制素有两种类型（抑制素 A 和抑制素 B），两者具有相同的-亚基，而-亚基因 N-端氨基酸序列的差异而分为 A 和 B，-亚基和 A、B 通过二硫键连接分别形成抑制素 A 和抑制素B1。抑制素 A 和抑制素 B 具有相似的生物活性，均可选择择性地抑制 SH 的合成与分泌，从而降低血液中的 FSH 水平2。其中-亚基上有两个端连接的糖基化位点，被认为是抑制素发挥生物学功能的活性中心，已有研究表明抑制素在卵泡生长、发育、闭锁和排卵过程中起重要作用3-4，此外国内外大量研究人员利用抑制素（INH）免疫来提高动物机体 FSH水平，且有文献证明 INH 基因免疫不仅可以提高动物体内FSH 水平，还可以提高排卵率和产仔数5-8。但由于目前所产生的 INH 免疫制剂（INH 抗原和 INH 抗体）由于产量低和免疫原性较差的问题，很难进行推广使用。重链抗体（HCAb）是在驼类动物血清中发现的一种特殊IgG，因其天然缺失轻链和第一恒定区（CH），所以被称为重链抗体。重链抗体的 N 端区域为抗原结合结构域（VHH），也被称为纳米抗体，与常规抗体中的 Fab 片段相比，VHH 就是功能和结构片段。纳米抗体分子结构的特殊性，使其具备了传统抗体不具备的优势：即分子量小、免疫原性低、易于表达、组织穿透力强9、稳定性强10、高抗原结合力。此外纳米抗体能够通过血脑屏障并迁移到中枢神经系统的组织中11，这使得纳米抗体具有很强的使用价值，在许多方面可替代普通抗体，弥补普通抗体的不足。1 材料与方法1.1 材料1.1.1菌株及载体 DH5 感受态细胞购自北京索莱宝科技有限公司；克隆载体 pMD19-T 购自 TaKaRa 公司；真核表达载体 PcDNA3.1 由新疆生产建设兵团绿洲生态实验室保存；抗抑制素 纳米抗体（Nb4）基因为本课题组利用噬菌体展示技术从前期构建的抗抑制素 纳米抗体文库中淘选获得。1.1.2主要试剂限制性核酸内切酶 EcoRI 和 HindIII、胰蛋白胨、琼脂粉购自 TaKaRa 公司；质粒小提试剂盒、DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京天根生化科技。1.1.3主要仪器 普通 PCR（labcyIer48）仪购自德国 Sensoquest公司；冷冻高速离心机（legendmicro17R 型）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。1.2 方法1.2.1Nb4 基因真核表达载体的构建1.2.1.1引物的设计使用双峰驼纳米抗体基因通用引物VHH-F 与 VHH-R，再设计出 1 对带有EcoRI和HindIII2个内切酶酶切位点的引物，以与真核表达载体相连。序列信息见表1：表 1 Nb4 基因引物序列基因引物序列片段大小退火温度VHH-F5-GAATTCCAGGTCCAACTGCAGGAGTCT-345064VHH-R5-AAGCTTTGAGGAGACGGTGACCTGGGT-3VHH-EcoRI-F5-CCGGAATTCCGGCAGGTCCAACTGCAGGAGTCT-368VHH-HindIII-R 5-CCCAAGCTTGGGTGAGGAGACGGTGACCTGGGT-31.2.1.2Nb4 基因的克隆 以实验室保存的 pCantab5E-Nb4模板用抗抑制素 纳米抗体的特异性引物（上下游各引物分别加入 EcoRI、Hand的酶切位点，上游：5CCGGAATTC-CGGCAGGTCCAACTGCAGGAGTCT3；下游：5CCCAAGCTTGGGTGAGGAGACGGTGACCTGGGT3）PCR 扩增目的基因，PCR体系（20 L）：模板 2 L，上、下游引物各 0.4 L，Mix12.5 L，ddH2O9.7 L。PCR 反应条件：95预变性 5min；94变性40s；57退火 1min；72延伸 30s；共 30 个循环；72再延伸 10min；4保存，并对 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳和胶回收。1.2.1.3pMD19-Nb4 重组质粒的构建及鉴定 对 PCR 产物胶回收后与 pMD19-T 载体进行 16水中过夜连接，待连接反应完成后将连接产物转入大肠杆菌的感受态细胞中。挑取数个单克隆菌落进行菌液 PCR，对含菌液 PCR 成功的单克隆菌落以 11000 体积比，向氨苄抗性的 LB 液体培养基中加入 20 L单克隆菌液，适宜条件下过夜培养对过夜培养物进行重组克隆质粒的提取，将提取的重组质粒用 EcoRI 和 HindIII 两种限制性内切酶 37双酶切 3h，并对双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后将目的基因条带进行胶回收。1.2.1.4PcDNA3.1-Nb4重组质粒的构建及鉴定 对pMD19-Nb4 重组质粒进行酶切的同时，对本实验室保存的 PcDNA3.1菌株扩繁后进行质粒提取。并使用 EcoRI 和 HindIII 限制性内切酶双重消化 PcDNA3.1 载体，进行琼脂糖凝胶电泳，并回收目的消化产物。将回收的 Nb4 基因片段与回收的 PcDNA3.1 载体进行 16水浴过夜连接，转化感受态细胞 DH5，涂布 LB固体氨苄培养基，37的培养箱中培养过夜。挑出单菌落进行菌液 PCR 鉴定，将 PCR 鉴定为阳性的菌落进行过夜扩大培养，次日提取菌液质粒，用双酶消化鉴定。然后送至测序并与模板序列比对。将菌液 PCR 鉴定正确的菌液使用 25甘油管保存今日畜牧兽医17于-20。2 结果2.1 Nb4 基因原核表达载体的构建2.1.1Nb4 基因克隆结果PCR 扩增后琼脂糖凝胶电泳结果显示产生一条 450bp 左右的特异性目的条带（图 1），PCR 产物与目的基因条带大小相符。图 1 Nb4 基因 PCR 扩增结果2.1.2pMD19-Nb4 重组质粒构建与鉴定结果将 PCR 扩增的 Nb4 基因与 pMD19-T 载体连接转化感受态细胞 DH5 感受态细胞后挑取单菌落进行菌液 PCR，琼脂糖凝胶电泳结果显示 PCR 产物大小与 NB4 基因大小一致（图 2）。挑选其中阳性菌进行扩繁后提取质粒，质粒双酶切后琼脂糖凝胶电泳结果显示出一条 2600bp 和一条 450bp 的条带（图 3）。与目的基因条带大小相符，初步判断 pMD19-Nb4 重组质粒构建成功。图 2 菌液 PCR 结果图 3 pMD19-Nb4 重组质粒双酶切结果2.1.3PcDNA3.1-Nb4 重组质粒的构建及鉴定结果将回收的 Nb4 基因片段与回收的 PcDNA3.1 载体进行连接及转化感受态细胞 DH5 细胞后，对菌液 PCR 阳性的单菌落进行扩繁，提取质粒进行双酶切后琼脂糖凝胶电泳结果显示出一条 5900bp 和一条 450bp 的条带（图 4），与预期结果一致。测序结果显示测序与 Nb4 基因序列完全一致，无突变情况，判断成功构建 pET32a-Nb4 重组质粒。图 4 PcDNA3.1-Nb4 重组质粒双酶切结果3 讨论本实验根据载体构建的传统流程，从克隆载体的连接到真核表达载体的构建，不同于现在的直接连接真核表达载体，虽然多了一个连接克隆载体的步骤，但是可以保留克隆载体，以方便以后构建其他载体时直接进行酶切连接。参考文献1 李万宏.抑制素 A 对猪卵泡颗粒细胞增殖和卵母细胞体外成熟的影响 D.长春:吉林大学,2015.2 吴结革,茆达干.抑制素基因免疫技术的研究进展 J.金陵科技学院学报,2009,25(4):89-93.3 Findlay J.K,Drummond A.E,Britt K.L,等.The roles of activins,inhibins and estrogen in early committed folliclesJ.Elsevier BV(1):81-87.4 Mcmullen Michelle-L.,Cho Byung-Nam,Yates C.-Jeana,等.Gonadal Pathologies in Transgenic Mice Expressing the Rat Inhibin-SubunitJ.The Endocrine Society(11):5005-5014.5 Sasaki Kazuaki,Medan Mohamed-S.,Watanabe Gen,等.Immunization of Goats against Inhibin Increased Follicular Devel-opment and Ovulation RateJ.Japanese Society of Animal Repro-duction(4):543-550.6 Mao Dagan,Bai Wujiao,Hui Fengming,等.Effect of in-hibin gene immunization on antibody production and reproductive performance in Partridge Shank hensJ.Elsevier BV(6):1037-1044.7 Samir Haney,Nagaoka Kentaro,Watanabe Gen.The stim-ulatory effect of subluteal progesterone environment on the su-perovulatory response of passive immunization against inhibin in goatsJ.Elsevier BV:188-195.8 Burkart Anna-D.,Mukherjee Abir,Mayo Kelly-E.Mech-anism of Repression of the Inhibin-Subunit Gene by Inducible 3,5-Cyclic Adenosine Monophosphate Early RepressorJ.The Endocrine Society(3):584-597.9 Cortez-retamozo Virna,Lauwereys Marc,Gh.Gholamre-za-Hassanzadeh,等.Efficient tumor targeting by single-domain antibody fragments of camelsJ.Wiley(3):456-462.10 Dumoulin Mireille,Conrath Katja,Meirhaeghe Annemie-Van,等.Single-domain antibody fragments with high conforma-tional stabilityJ.Wiley(3):500-515.11 Abulrob Abedelnasser,Sprong Hein,Henegouwen Paul-Van-Bergen-en,等.The blood-brain barrier transmigrating single domain antibody:mechanisms of transport and antigenic epitopes in human brain endothelial cellsJ.Wiley(4):1201-1214.