抗纤软肝颗粒对肝纤维化大鼠...路核转录因子Gli1的影响_张爽.pdf

中西医结合研究 年月第 卷第期 .，.，.：实 验 研 究 湖北省卫生厅中医药、中西医结合科研一般重点项目（）通信作者，：抗纤软肝颗粒对肝纤维化大鼠 通路核转录因子 的影响张爽江诗怡高翔詹磊陆定波 湖北中医药大学第一临床学院，武汉 湖北省中医院肝病科，武汉 摘要目的观察抗纤软肝颗粒对肝纤维化模型大鼠 通路核转录因子 的影响。方法将 只 级 大鼠随机分成空白对照组，模型组，抗纤软肝颗粒低、中、高剂量组和环靶明对照组。除空白对照组外，所有实验大鼠均以四氯化碳（）复合因素法诱导肝纤维化模型周。第周开始给药干预，抗纤软肝颗粒低、中、高剂量组分别给予 、相应药物灌胃，环靶明对照组给 环靶明灌胃；均连续灌胃周，灌胃期间造模继续。采用酶联免疫吸附试验检测各组大鼠肝功能指标及型胶原水平；采用 银染法观察各组肝脏组织病理学改变；采用 法检测各组大鼠肝组织 表达水平，法检测各组大鼠肝组织 蛋白质表达水平，免疫组化法检测各组大鼠肝组织 表达。结果 银染显示，模型组大鼠肝组织中胶原纤维广泛增生，纤维间隔相互连接，假小叶形成；抗纤软肝颗粒各剂量组大鼠肝脏组织纤维化程度较模型组减轻，但不如环靶明对照组。与模型组比较，抗纤软肝颗粒中、高剂量组、环靶明组血清丙氨酸氨基转移酶（，）、天冬氨酸氨基转移酶（，）水平显著降低（），且高剂量组显著低于低剂量组（）；与模型组比较，抗纤软肝颗粒低、中、高剂量组型胶原含量明显降低（），且高剂量组明显低于低、中剂量组（）；与环靶明对照组比较，抗纤软肝颗粒高剂量组 、水平及型胶原含量差异无统计学意义（）。与模型组比较，抗纤软肝颗粒各剂量组 及蛋白表达均降低（）；与环靶明对照组比较，抗纤软肝颗粒中、高剂量组 差异无统计学意义（），而抗纤软肝颗粒各剂量组 蛋白表达均增加（）。免疫组化结果显示，抗纤软肝颗粒各剂量组大鼠肝脏组织 的表达较模型组出现不同程度减少，其中以高剂量组减少最显著，但各剂量组减少程度均不如环靶明对照组。结论抗纤软肝颗粒对 复合因素法所致的大鼠肝纤维化有保护作用，其作用机制可能与下调 通路核转录因子 有关。关键词肝纤维化；抗纤软肝颗粒；通路；中图分类号 ；文献标志码 ，中西医结合研究 年月第 卷第期 .，.，.，（），（）（）（），（），（），（），（），（）（），（），；抗纤软肝颗粒系本院名中医肝病专家张赤志教授创立的经验方。张教授根据自己长期治疗肝硬化的经验和体会，认为肝纤维化是肝硬化“证未显现”阶段，痰瘀互结为其总病机，治疗当以化痰软坚、活血化瘀为法。前期临床观察发现，抗纤软肝颗粒对降低肝纤维化相关的血清学指标透明质酸酶（，）、层黏连蛋白（，）、型前胶原（，）、型胶原（，）等效果显著，对肝功能和肝脏硬度值亦有较明显改善。人肝星状细胞系 体外实验研究表明：抗纤软肝颗粒能够下调 细胞 （）信号通路核转录因子 表达，从而抑制肝星状细胞（，）活化，这可能是其减轻肝纤维化程度、延缓病程进展的作用机制之一。为深入研究抗纤软肝颗粒在肝纤维化方面的治疗作用，本研究以四氯化碳（）复合因素法诱导肝纤维化大鼠模型，探讨抗纤软肝颗粒对肝纤维化模型大鼠 信号通路核转录因子 的影响，现报道如下。材料与方法 主要实验用品 实验动物 级 大鼠 只，雌雄各半，体重 ，由湖北省实验动物研究中心提供，实验动物合格证号：（鄂）。药物及试剂抗纤软肝颗粒（批准文号：鄂药制字 ），由海藻、醋鳖甲、牡蛎、莪术、丹参、净山楂、地骷髅等组成，由湖北省中医院制剂中心生中西医结合研究 年月第 卷第期 .，.，.产，生药含量为 ；环靶明（，美国 公司）。丙氨酸氨基转移酶（，）检测试剂盒（，长春汇力公司）、天 冬 氨 酸 氨 基 转 移 酶（，）检测试剂盒（，长春汇力公司）；兔多抗（，公司）。仪器设备全自动生化分析仪（，公司），实时荧光定量 仪（，美国 公司）。实验方法 动物的造模与给药 级 大鼠 只，标准饲料喂养，自由饮水。将大鼠随机分成组，分别为空白对照组、模型组、环靶明对照组（）、抗纤软肝颗粒低、中、高、剂量（、）组，每组 只。除空白对照组外，所有实验大鼠采用 橄榄油溶液行背部皮下注射造模，按 次的剂量（首次剂量为 次），每周次；同时辅以低蛋白、低胆碱、高脂肪（饲料中含猪油）、高胆固醇（饲料中含胆固醇 ）饮食，造模周。第周开始灌胃给药，抗纤软肝颗粒低、中、高剂量组分别给予相应的药物及剂量灌胃，环靶明对照组给予环靶明灌胃。按大鼠体质量灌胃，灌胃容量为 ，次，连续周（灌胃期间继续给予 橄榄油溶液皮下注射）。动物处置及标本制备第 周末处死大鼠。末次给药后，禁食不禁水，大鼠称重后以 水合氯醛进行麻醉，腹主动脉取血后，颈椎脱臼处死，手术摘取肝脏，用预冷的生理盐水清洗，拭干，称重。将收集的全血离心分离血清，置于 冰箱保存备用。取大鼠左叶肝脏约 大小固定于多聚甲醛固定液中，以制备石蜡切片，余下肝组织置于 液氮速冻保存备测。肝脏组织病理检测采用 银染法观察各组肝脏组织病理学改变。肝功能指标检测采用酶联免疫吸附试验检测各组大鼠血清 、型胶原水平。肝脏组织 及蛋白质表达水平检测 法检测各组大鼠肝组织 表达水平，引物序列见表。反应条件为 ，；，；绘制溶解曲线，采用 方法分析目的基因 相对表达量。法检测各组大鼠肝组织 蛋白质表达水平。免疫组化法检测各组大鼠肝组织 表达。表引物序列基因名引物序列（）产物大小 统计学方法采用 统计软件进行数据统计分析，计量资料采用均数标准差（?）表示，组间比较采用单因素方差分析，以 表示差异具有统计学意义。结果 各组大鼠肝脏组织病理学改变 银染后，空白对照组可见肝小叶结构完整、肝细胞排列整齐；而模型组大鼠肝组织中胶原纤维广泛增生，纤维间隔相互连接，假小叶形成；环靶明对照组大鼠肝细胞无显著纤维化，且肝小叶相对结构完整、肝细胞排列相对整齐；随着抗纤软肝颗粒浓度的升高，抗纤软肝颗粒各剂量组大鼠肝细胞纤维化程度依次逐渐减轻，但各剂量组改善幅度均低于环靶明对照组。见图。：空白对照组；：模型组；：抗纤软肝颗粒低剂量组；：抗纤软肝颗粒中剂量组；：抗纤软肝颗粒高剂量组；：环靶明对照组。图各组大鼠肝组织 银染图（）中西医结合研究 年月第 卷第期 .，.，.各组大鼠肝功能指标及型胶原变化与空白对照组比较，模型组、抗纤软肝颗粒低剂量组 、水平均显著增高（），而抗纤软肝颗粒中、高剂量组 、水平差异无统计学意义（）；与模型组比较，抗纤软肝颗粒中、高剂量组、环靶明组 、水平均显著降低（），且高剂量组显著低于低剂量组（）；与环靶明对照组比较，抗纤软肝颗粒高剂量组 、水平差异无统计学意义（）。与空白对照组比较，模型组及抗纤软肝颗粒各剂量组型胶原含量均有明显升高（）；与模型组比较，抗纤软肝颗粒低、中、高剂量组型胶原含量明显降低（），其中与低、中剂量组相比，高剂量组降低更为明显（）；与环靶明对照组比较，抗纤软肝颗粒高剂量组型胶原含量差异无统计学意义（）。见表。表各组大鼠 、型胶原变化（，?）组别 （）（）型胶原（）空白对照组 模型组 抗纤软肝颗粒低剂量组 抗纤软肝颗粒中剂量组 抗纤软肝颗粒高剂量组 环靶明对照组 与空白对照组比较 ，；与模型组比较 ，；与环靶明对照组比较 ，；与抗纤软肝颗粒低剂量组比较 ，；与抗纤软肝颗粒中剂量组比较，各组大鼠肝组织 及蛋白表达 检测结果：与空白对照组比较，模型组、抗纤软肝颗粒低剂量组大鼠肝组织 均增高（），而抗纤软肝颗粒中、高剂量组 差异无统计学意义（）；与模型组比较，抗纤软肝颗粒低、中、高剂量组 均降低（）；与环靶明对照组比较，抗纤软肝颗粒中、高剂量组 差异无统计学意义（）。见表。检测结果：与空白对照组相比，模型组、抗纤软肝颗粒低、中、高剂量组 蛋白表达均增高（）；与模型组比较，抗纤软肝颗粒低、中、高剂量组 蛋白表达量均降低（），其降低程度依剂量呈正相关；与环靶明对照组比较，抗纤软肝颗粒低、中、高 剂 量 组 蛋 白 表 达 均 增 加（），且增加程度依剂量呈负相关。见图及表。免疫组化结果：空白对照组大鼠肝脏组织 着色较浅，仅有微量表达；模型组大鼠肝脏组织 着色较深，汇集大量 。环靶明对照组大鼠较模型组而言，着色明显变浅，表达明显减弱。在抗纤软肝颗粒的干预下，各剂量组大鼠肝脏组织 的表达较模型组出现不同程度减轻，其中以高剂量组改善最显著，但各剂量改善幅度均低于环靶明对照组。见图。表各组大鼠肝组织 及蛋白表达比较（，?）组别 相对表达量 蛋白质相对表达量空白对照组 模型组 抗纤软肝颗粒低剂量组 抗纤软肝颗粒中剂量组 抗纤软肝颗粒高剂量组 环靶明对照组 与空白对照组比较 ，；与模型组比较 ，；与环靶明对照组比较 ，；与抗纤软肝颗粒低剂量组比较 ，；与抗纤软肝颗粒中剂量组比较 ，中西医结合研究 年月第 卷第期 .，.，.：空白对照组；：模型组；：抗纤软肝颗粒低剂量组；：抗纤软肝颗粒中剂量组；：抗纤软肝颗粒高剂量组；：环靶明对照组。图各组大鼠肝组织中 与 蛋白表达（）：空白对照组；：模型组；：抗纤软肝颗粒低剂量组；：抗纤软肝颗粒中剂量组；：抗纤软肝颗粒高剂量组；：环靶明对照组。图各组大鼠肝组织 免疫组化染色结果（）讨论肝纤维化时，中 （）信号通路被异常激活。信号通路通过 配体，如 （），（）和 （），结合到 受体 （）上，然后激活 蛋白偶联受体（，）；激活的 反过来促进胶质母细胞瘤（）家族转录活性形式（、和 ）的产生，从而导致核转录因子 与下游基因启动子区处于结合状态，调控下游靶基因的转录表达，并使 活化，最终导致肝纤维化的发生。因此，被认为是 通路活性的可靠指标。环靶明是目前国际公认的且研究较为清楚的 通路 抑 制 剂 之一，其通 过 抑 制 活 性 因 而 遏 制 活化。但是环靶明对人体会产生严重致畸反应，限制了其作为药物在临床上的应用。故将此药品作为本实验治疗组的阳性对照。张赤志教授认为，痰凝和血瘀贯穿于肝纤维化、肝硬化发生发展过程的始终，在其病因病机中占据核心地位。抗纤软肝颗粒由海藻、鳖甲、牡蛎、莪术、丹参、山楂、地骷髅等组成，具有“化痰软坚、活血化瘀”之功效。本方特点是通过软坚散结、消痞化积，使肝内瘀血“融化”，再用活血化瘀之品将其“驱出”，从而达到抗肝纤维化的目的。相关药理学研究表明，海藻具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、调节免疫及降血脂等作用；鳖甲是治疗肝纤维化的基本药物，可以调节 、和 信号通路，有效消除细胞外基质、抑制 活化和增殖 ；牡蛎可以有效减少血清中 、的含量，降低转氨酶的浓度，保护肝细胞；莪术具有抗癌、抗血栓、抗肝纤维化、降血脂等多种功效；丹参具有抗炎、抗菌、抗肝纤维化、抗肿瘤以及保护心血管等药理学作用；山楂可减轻急性肝损伤，其机制与抗脂质过氧化、抗氧化和减轻炎症反应有关。本实验研究结果表明：抗纤软肝颗粒可有效改善肝纤维化大鼠的肝功能及纤维化指标，改善肝组织形态学表现，同时能下调肝纤维化大鼠肝脏内 表达；提示抗纤软肝颗粒可能通过调控 信号通路发挥抗纤维化作用。抗纤软肝颗粒各剂量组以高剂量组疗效最好，但与环靶明对照组相比，疗效有不及之处，不排除药物干预是在造模后、时间较短等因素，需在今后进行优化和更深入的研究。参考文献张赤志，严红梅，王丽 抗纤软肝冲剂治疗肝硬变 例 中西医结合肝病杂志，（）：蒋满红，刘璐，孟艳平抗纤软肝颗粒治疗肝纤维化的临床研究 中医药导报，（）：黄大伟，陆定波，高翔，等 抗纤软肝颗粒调控 通路核转录因子 抑制肝星状细胞活化的研究中西医结合肝病杂志，（）：，：，（）：，中西医结合研究 年月第 卷第期 .，.，.，：，（）：罗秀芳，陈菊屏 信号通路与纤维化疾病的研究进展现代临床医学，（）：孙艳，己二酮致人卵巢颗粒细胞凋亡及 信号通路调控机制 的 研 究 福 州：福 建 医 科 大学，：，（）：，：，（）：程良斌 张赤志教授从痰论治肝硬化的经验 中西医结合肝病杂志，（）：王祺瑶，卢畅，彭婵妮，等海藻岩藻多糖抗肿瘤活性研究新进 展 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报，（）：，（）：，：，（）：杨勇进，张翠萍，张民生，等牡蛎提取物对酒精性肝损伤大鼠 与 的影响世界 华 人 消 化 杂 志，（）：，（）：戴新新，宿树兰，