雷公藤甲素改善博来霉素所致...肺功能及内质网应激作用机制_宋倩男.pdf

收稿日期：；修订日期：基金项目：中国博士后科学基金第 批特别资助（）；黑龙江省博士后科研启动金资助项目（）；黑龙江省自然科学基金（）黑龙江省中医药科研项目（）作者简介：宋倩男（），女（汉族），黑龙江哈尔滨人，黑龙江中医药大学在读硕士研究生，主要从事呼吸系统疾病研究工作通讯作者简介：陈 宏（），男（汉族），黑龙江哈尔滨人，黑龙江中医药大学附属第一医院主任医师，博士学位，主要从事呼吸系统疾病研究工作雷公藤甲素改善博来霉素所致肺纤维化模型小鼠肺功能及内质网应激作用机制宋倩男，李 淼，李贵星，邓琳千，张明浩，冯大庆，李可心，陈 宏（黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨）摘要：目的 观察和评价分析雷公藤甲素（，）改善博来霉素（，）所致肺纤维化模型小鼠肺功能及内质网应激（，）作用的相关机制。方法 昆明小鼠 只，雌雄各半，分成 组：对照组、模型组、地塞米松组及雷公藤甲素低、中、高浓度组各 只。经气管插管雾化注射 建立肺纤维化小鼠模型。造模后第 天开始灌胃给予地塞米松或者 进行治疗，每两天给药一次，持续给药。观察小鼠一般情况，检测小鼠用力肺活量（）、秒率（）、质量、吸气阻力（）、呼气阻力（）、动态肺顺应性（），并用 和免疫组织化学染色分析肺组织中葡萄糖调节蛋白（）和 同源蛋白（）的表达情况。结果 与对照组相比，模型组 降低、秒率升高、质量 下降、降低；与模型组相比，地塞米松组及 低、中、高浓度组 升高、秒率降低，质量 和 升高，高浓度组 和质量 回升更明显，升高。病理可见模型组小鼠的肺组织实变区内慢性炎性细胞浸润，大量胶原沉积，高表达的 和 蛋白主要定位于空泡化的型肺泡上皮细胞（）。高浓度组小鼠炎症缓解，胶原沉积减少，肺组织中 和 蛋白的表达均减少。结论 能够明显改善小鼠肺功能，减少肺间质胶原沉积，可能与调节纤维化肺组织实变区内 的 和 蛋白表达，缓解 压力，恢复 的正常功能有关。关键词：雷公藤甲素；博来霉素；肺纤维化；内质网应激（）标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（）肺间质纤维化是以慢性进行性弥漫性肺间质纤维增生和限制性通气功能障碍为特点的肺间质性疾病，它是许多肺间质疾病的共同结局，是呼吸衰竭的主要病理基础，病程一般呈进行性发展。肺纤维化具有早期以间质细胞浸润，晚期以肺间质胶原纤维沉积为特点，一旦进入晚期则很难逆转，。即上皮间质转化（，）是在凝胶中培养的晶状体上皮细胞失去了极性，转变成为具有伪足的间质样细胞。肺部特有的组织结构特性和免疫特性使得肺上皮细胞更容易发生，而肺与其他器官相比更容易产生纤维化，。本研究拟通过 标志性蛋白葡萄糖调节蛋白（）和 同源蛋白（）的表达情况来探讨雷公藤甲素对肺纤维化小鼠的作用及相关机制。材料与仪器 实实验验动动物物 动物品系：选用 级别昆明小鼠，雌雄各半。其中雌鼠体重范围为 ，雄鼠体重范围为 。动物引进参照试验动物引进标准操作规程进行，购于中国食品药品检定研究院，生产许可证：（京）。药药物物 盐酸雷公藤甲素（百灵威科技有限公司 批号：），纯度：，密封避光低温保存。博来霉素（硫酸盐）批号：，：，购自大连美仑生物技术有限公司。试试剂剂与与仪仪器器 倒置相差显微镜（）（奥林巴斯），生物安全柜（）（西班牙泰事达），台式离心机（）赛默飞世尔科技（中国）有限公司。雷公藤甲素混悬液的配制：称取雷公藤甲素 ，混悬于 的 的羧甲基纤维素溶液中，配成 的混悬液。博来霉素溶液的配制：称取 硫酸博来霉素，溶于 生理盐水中，配制成 的溶液。生理盐水的配制：称取 ，溶于 的无菌水中。方法 模模型型制制备备与与分分组组 动物实验设对照组、组为模型组、（）和 （）剂量组，每组动物 只。肺纤维化小鼠建模方法为气管灌注给予 水溶液，对照组用同样给予等体积的生理盐水。组 只小鼠、地塞米松组 只小鼠、组 只小鼠，雌雄各半。分组后第二天开始给予小鼠药物治疗，开始灌胃给予地塞米松或者雷公藤甲素进行治疗，每两天给药一次，持续给药。剂量（低剂量组）、剂量（中剂量组）、剂量（高剂量组）各 只小鼠灌胃给药治疗。每天观察小鼠的活动状态，每天称重并给药，连续给药 天。观观察察项项目目及及方方法法 肺肺功功能能 戊巴比妥钠（）腹腔内注射麻醉。行气管切开术后气管插管，并将插管与气管结扎固定，气管切口下垫一次性采血针针帽，防止组织液或血液从气管切开处进入气管，影响肺功能的检测。小鼠仰卧位于中型体描箱内，连接呼吸机，设置呼吸比：，呼吸频率 次。以 压力控制方式检测用力肺活量（）、秒率（）、动态肺顺应性（）、吸气阻力（）、呼气阻力（）和质量（肺脏质量）。肺肺组组织织病病理理 肺功能检测后，解剖分离肺组织，称重。左肺下半叶固定于 福尔马林溶液，石蜡包埋，冠状面切片，时珍国医国药 年第 卷第 期和 染色观察、拍照。、蛋蛋白白表表达达 取 左肺上叶组织置于玻璃研磨器中，每 加入 裂解液和 ，于冰上反复研磨制备组织匀浆，、离心 ，取上清，法进行蛋白定量，按：的比例加入 蛋白上样缓冲液，。每孔 蛋白样品上样，湿法转移至 膜，一抗 孵育过夜，洗涤 次，二抗室温孵育，洗涤 次，发光液暗室孵育，凝胶成像系统成像。用 软件对目的条带进行灰度分析，计算相对积分光密度值。严格按即用型免疫组化试剂盒说明书操作。常规烘片、脱蜡、抗原灭活，热修复抗原，阻断内源性过氧化物。一抗：兔来源，抗体（：）孵育过夜；二抗：生物素化山羊抗兔 恒温箱 孵育 ，显色，常规苏木素复染，脱水、透明、封片。用抗体稀释液代替一抗做阴性对照。数字切片扫描仪记录切片染色结果。统统计计方方法法 应用 软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料应用均值士标准差（?）表示，采用单因素 进行检验（方差齐采用 检验，方差不齐采用 检验）。为检验水准。结果 对对肺肺纤纤维维化化小小鼠鼠 、秒秒率率、质质量量 的的影影响响 与对照组相比，模型组 降低、秒率升高、质量 下降；与模型组相比，地塞米松组及 低、中、高浓度组 升高、秒率降低、质量 升高，高浓度组 和质量 回升更明显，差异具有统计意义（均 ）。表 对肺纤维化小鼠、秒率、质量 的影响（?）组别（）秒率 （）质量（）对照组 模型组 地塞米松组 高浓度组 中浓度组 低浓度组 与对照组相比，；与模型组相比，；与地塞米松组，雷公藤甲素中浓度组，雷公藤甲素低浓度组相比，；模型组比对照组 增加（），给药组与对照组相比差异无统计学意义。与对照组比较，模型组、地塞米松组及雷公藤甲素低、中浓度组 增加（），而雷公藤甲素高浓度组差异无统计学意义（）。模型组比对照组 下降（），给药组比模型组增加（）。结果见表 所示。表 对肺纤维化小鼠呼吸阻力及肺顺应性的影响（?）组别（）（）（）对照组 模型组 地塞米松组 高浓度组 中浓度组 低浓度组 与对照组相比，；与模型组相比，；与地塞米松组，雷公藤甲素中浓度组，雷公藤甲素低浓度组相比，；雷雷公公藤藤甲甲素素对对肺肺纤纤维维化化小小鼠鼠肺肺组组织织中中 和和 蛋蛋白白表表达达的的影影响响 病理可见模型组小鼠的肺组织实变区内慢性炎性细胞浸润，大量胶原沉积，高表达的 和 蛋白主要定位于空泡化的型肺泡上皮细胞（）。雷公藤甲素高浓度组小鼠炎症缓解，胶原沉积减少，肺组织中 和 蛋白的表达均减少（）。讨论肺纤维化，没有完全与之相对应的中医病名，根据其病因病机、症状特点分析，本病应属中医“肺痹肺痿”的范畴。内质网应激（）作为多种应激源的共同通路，通过未折叠蛋白反应（）信号系统与不同性质的炎症反应偶合，广泛参与多种疾病的发生和发展，。随着对、与炎症偶联的分子机制逐渐明确，人们将更好地理解慢性病的发病机制，为治疗炎性疾病提供新的治疗靶点和开辟新的治疗途径。表 对肺纤维化小鼠肺组织中 和 蛋白表达的影响（?）组别 对照组 模型组 地塞米松组 高浓度组 中浓度组 低浓度组 与对照组相比，；与模型组相比，；与地塞米松组，雷公藤甲素中浓度组，雷公藤甲素低浓度组相比，；中医药治疗本病具有一定的优势，不仅可以减少西药的副作用，还可以抗纤维化作用，提高生活质量。中医认为多系先天禀赋缺乏，肺肾亏虚；邪气侵袭，耗伤人体是引起肺痿病变的起始原因。当博来霉素引发的 被抑制剂阻断后，肺成纤维细胞减少并能有效改善肺功能。雷公藤甲素（）对小鼠白血病、有抗肿瘤活性；对小鼠白血病 有明显的疗效，也可抑制乳腺癌与胃癌的细胞软琼酯集落形成，抑制率 以上。雷公藤甲素能够在极低的浓度（）诱导滑膜成纤维细胞凋亡。雷公藤甲素可以降低细胞中环氧化酶 （）以及诱导型 合酶（）的表达水平，从而减少 的生成，抑制炎症反应。可以降低细胞中多个细胞因子（）以及黏附分子（）的表达水平，抑制多种炎性细胞如中性粒细胞、巨噬细胞等的活化过程，抑制病灶处的炎性细胞浸润程度，最终抑制炎症反应过程。雷公藤甲素可以降低 诱导的肺纤维化模型小鼠的肺系数和肺组织胶原含量，降低肺组织纤维化程度评分，为肺纤维化的治疗提供了新的先导化合物，可以基于雷公藤甲素开发治疗肺纤维化的药物。通过本研究，与对照组相比，模型组 降低、秒率升高、质量 下降、降低；与模型组相比，地塞米松组及雷公藤甲素低、中、高浓度组 升高、秒率降低，雷公藤甲素高浓度组 回升更明显，升高，差异具有统计意义。模型组比对照组 增加，给药组与对照组相比差异无统计学意义。与对照组比较，模型组、地塞米松组及雷公藤甲素低、中浓度组 增加，而雷公藤甲素高浓度组差异无统计学意义。模型组比对照组 下降（），给药组比模型组增加。病理可见模型组小鼠的肺组织实变区内慢性炎性细胞浸润，大量胶原沉积，高表达的 和 蛋白主要定位于空泡化的型肺泡上皮细胞（）。雷公藤甲素高浓度组小鼠炎症缓解，胶原沉积减少，肺组织中 和 蛋白的表达均减少。因此，雷公藤甲素能够明显改善小鼠肺功能，减少肺间质胶原沉积，可能与调节纤维化肺组织实变区内 的 和 蛋白表达，缓解 压力，恢复 的正常功能有关。参考文献：王志超，冯凡超，顾诚，等 内质网应激：特发性肺纤维化的潜在治疗方向 中国呼吸与危重监护杂志，（）：陈 圻，黄文海，沈正荣，等 上皮 间质转化在肺纤维化中的研究进展 中国现代应用药学，（）：彭礼波，董瑶瑶，张志坚 内质网应激与氧化应激在百草枯致大鼠肺纤维化中的作用 重庆医学，（）：，时珍国医国药 年第 卷第 期 ，（）：，（）：赵 红，姚平波 调节 表达抑制内质网应激介导肺成纤维化细胞凋亡 中国免疫学杂志，（）：刘 营，刘乃国，王 楠 肺纤维化中，（）对内质网应激及 表达的影响 医学研究生学报，（）：，（）：王 娜，杨 萌，雷素英，等 多聚鸟苷酸干预大鼠矽肺纤维化的内质网应激作用机制 中国职业医学，（）：高伟华，柴立民，杨颖溪，等 补肾益肺消癥方对肺纤维化大鼠内质网应激及 信号通路关键分子表达的影响 辽宁中医杂志，（）：，；，（）：杨颖溪，柴立民，吴甜甜，等 补肾益肺消癥方对特发性肺纤维化大鼠 信号通路关键分子基因和蛋白表达的影响 北京中医药大学学报，（）：张彦伟，张志强，吴丽贤，等 雷公藤内酯醇减少放射性肺纤维化中肌成纤维细胞活化与抑制 通路相关 中国药理学通报，（）：金 笛，何 丽，张海锋 内质网应激相关蛋白与 蛋白在特发性肺纤维化中的表达及意义 重庆医学，（）：申萌萌，南亚楠，唐 磊，等 麦门冬汤对肺纤维化大鼠肺功能及内质网应激作用的影响 北京中医药大学学报，（）：收稿日期：；修订日期：基金项目：国家自然科学基金（）；河南省中医药学科领军人才工程项目豫卫中医函（）号；河南省中医管理局国家中医临床研究基地科研专项重点课题（）；河南省中医药管理局国家中医临床研究基地科研专项普通项目（）；河南中医药大学第一附属医院横向课题（）作者简介：陈晨晨（），女（汉族），河南睢县人，河南中医药大学在读硕士研究生，主要从事中医药防治小儿肾脏疾病的研究工作通讯作者简介：宋纯东（），男（汉族），河南民权人，河南中医药大学第一附属医院主任医师，博士研究生导师，博士学位，主要从事中医药治疗肾小球疾病机制研究工作雷公藤多苷对紫癜性肾炎患儿血清 表达的影响陈晨晨，宋 丹，宋纯东，马金玉，杨晓青，张 霞，任献青，翟文生，丁 樱（河南中医药大学，河南