雷公藤甲素诱导肝细胞选择性自噬的形态学观察_蒋杨雨.pdf

现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.2JAN.2023doi:10.13241/ki.pmb.2023.02.002雷公藤甲素诱导肝细胞选择性自噬的形态学观察*蒋杨雨江始源曹丹王海燕邹昊靖李健（北京中医药大学中医学院组胚教研室 北京 102488）摘要 目的：观察雷公藤甲素诱导肝细胞选择性自噬的水平。方法：在雷公藤甲素给药处理小鼠的尾静脉高压注射 GFP-LC3 质粒，制备肝细胞自噬示踪模型，观察雷公藤甲素在动物体内诱导肝细胞自噬的水平。在 GFP-LC3 稳定表达的 L02 细胞株中转入RFP-P62 质粒，用活细胞工作站和荧光显微镜动态观察雷公藤甲素诱导 L02 细胞选择性自噬的轮廓，同时也观察细胞自噬复合体LC3-P62 的变化。结果：动物实验结果表明，雷公藤甲素可显著诱导肝细胞自噬体的形成，Western blot 结果显示 P62 蛋白和 LC3II蛋白的表达趋势一致。活细胞动态观察及免疫荧光双标记实验结果表明 LC3-P62 存在共定位，提示雷公藤甲素可诱导肝细胞自噬流的形成。结论：雷公藤甲素可诱导肝细胞选择自噬，其生物学意义可能与肝细胞损伤后修复相关。关键词：选择性自噬；雷公藤甲素；肝细胞；形态学中图分类号：R-33；Q593.1文献标识码：A文章编号：1673-6273（2023）02-206-05Morphologic Observation of Hepatocyte Selectively Autophagy Inducedby Triptolide*JIANG Yang-yu,JIANG Shi-yuan,CAO Dan,WANG Hai-yan,ZOU Hao-jing,LI Jian(Department of Histology and Embryology,School of Traditional Chinese Medicine,BUCM,Beijing,102488,China)ABSTRACT Objective:To observe the level of hepatocyte selective autophagy induced by triptolide.Methods:An autophagy trac-ing model in hepatocytes was established by rapid tail vein injection of GFP-LC3 plasmids into mice treated with triptolide to observe thehepatocyte autophagy level induced by triptolide in vivo.GFP-LC3 stable expressed L02 cells were transfected with RFP-P62 plasmid,and the selective autophagy profile of L02 and LC3-P62 complex induced by triptolide were dynamically observed by live cell imagingsystem and fluorescence microscopy.Results:The results of in vivo experiments showed that triptolide significantly induced autophagyin hepatocytes.And a similar trend on the protein expression of LC3II and P62 was demonstrated by Western blot.The results of live cellimaging system and fluorescence microscopy showed the co-localization of LC3 and P62 suggesting that the triptolide could induce au-tophagy flux.Conclusion:Triptolide induced selective autophagy in hepatocytes and its biological function might be associated withhepatocyte damage repairing after injury.Key words:Selectively autophagy;Triptolide;Hepatocyte;MorphologyChinese Library Classification(CLC):R-33;Q593.1Document code:AArticle ID:1673-6273(2023)02-206-05*基金项目：国家自然科学基金面上项目（81873099）作者简介：蒋杨雨（1996-），女，硕士研究生，研究方向：有毒中药 毒/效 相关的机制，E-mail：J通讯作者：李健，博士，教授，博士生导师，研究方向：中医药防治肝病（脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化）的作用机制；有毒中药 毒/效 相关的机制，E-mail:（收稿日期：2022-04-23 接受日期：2022-05-18）前言雷公藤甲素（Triptolide，TP）是环氧二萜内酯化合物，是中药雷公藤中最主要的活性成分和质控成分，也是导致雷公藤制剂在临床应用中出现各类不良事件/副反应的主要物质1,2。已有的研究结果揭示，雷公藤甲素的毒理机制包括：诱导氧化应激，导致细胞损伤3；抑制相关通路致胆汁酸代谢紊乱，抑制糖异生4；损伤线粒体功能，诱导细胞自噬及凋亡5,6等。近年来，从细胞自噬和凋亡的角度探讨雷公藤毒理机制是研究热点之一6-8。作者所在课题组已报道了肝细胞自噬与雷公藤甲素的肝毒性有关9。为了进一步探究雷公藤甲素是否促进肝细胞自噬流的发生及其相关作用机制，本文应用动物和细胞实验，动态观察了自噬体形成标志蛋白 LC3-与自噬流形成关键蛋白 P62 的表达模式，明确了雷公藤甲素通过促进 LC3与 P62 的耦连，短暂升高 P62 蛋白的表达，诱导自噬流的形成。该实验结果能初步揭示雷公藤制剂诱导肝毒性的毒理机制。1 材料与方法1.1 实验材料GFP-LC3 稳定转染 L02 细胞株（人正常肝细胞系）为本实验室保存的细胞株；6 周龄雄性昆明种小鼠购自北京维通利华实验动物公司(动物许可证号：SCXK（京）2016-0011)，动物实验206现代生物医学进展Progress in Modern Biomedicine Vol.23NO.2JAN.2023各项操作通过北京中医药大学动物实验伦理委员会批准；雷公藤甲素购自南京泽朗医药科技有限公司（纯度99%）；LC3-B抗体(Cat：Ab51520)和 P62 抗体（Cat：Ab207305）购自 Abcam公司；-actin 抗 体（Cat：66009-1-Ig）、-tubulin 抗 体（Cat：66031-1-Ig）和羊抗鼠 IgG（Cat：SA00001-1）购自 Proteintech 公司；GFP-LC3 质粒由北京医科大学佑安医院实验中心娄金丽教授慧赠，质粒抽提试剂盒购自 Promega 公司。质粒转染试剂（Lipofectamin 2000）购自 Thermo Fisher Scientific 公司。其余常规试剂、耗材均购自北京百诺威生物科技有限公司。1.2 实验方法1.2.1 小鼠尾静脉高压注射 GFP-LC3 质粒法探测雷公藤甲素诱导肝细胞自噬依照常规方法扩增、抽提 GFP-LC3 质粒。15 只雄性昆明种小鼠适应性喂养一周后，将 10 g GFP-LC3质粒混合于 2 mL PBS 溶液中，在 10 s 内经尾静脉注射到小鼠体内10。质粒注射 48 h 后，将小鼠随机分为 2 组，溶剂对照组（3只）和药物干预组（12 只）。根据课题组前期实验结果，将药物干预组小鼠腹腔注射雷公藤甲素的干预剂量定为 0.5 mg/kg，溶剂对照组小鼠腹腔注射 DMSO 溶液。于注射后 3、6、12 及24 h，从药物干预组和溶剂对照组各随机选取 3 只小鼠麻醉、处死、取肝组织。一部分肝组织经 OCT 包埋、冰冻切片、在荧光显微镜下观察 LC3 的表达；另一部分肝组织经匀浆、总蛋白抽提及蛋白定量，用于 Western blot 检测。1.2.2 LC3 与 P62 蛋白共定位的动态观察（1）质粒转染及药物孵育：复苏并扩增稳定转染 GFP-LC3 的 L02 细胞，取对数生长期的 L02 细胞接种于 5 个共聚焦显微镜专用培养皿，贴壁后用质粒瞬时转染试剂将 RFP-P62 质粒转入 L02 细胞内。经荧光显微镜初步鉴定并确认质粒转染成功后，分别加入 DMSO和 10 nM、25 nM、50 nM、100 nM 的雷公藤甲素工作液，孵育24 h，经冷丙酮固定，于荧光显微镜下观察、摄片。（2）活细胞观察：实验分组及干预同前，将培养皿置入活细胞工作站，加入雷公藤甲素（50 nM）后，每 20 min 记录一次GFP-LC3 和 P62 的轮廓，累计观察 120 min，分析雷公藤甲素对细胞内 P62 蛋白水平变化的影响。1.3 统计学分析对肝组织内 GFP-LC3 的荧光强度照片（10 个视野/组）做图像分析，计算荧光面积，定量数据用 SPSS 25.0 软件作ANOVA 单因素方差分析，组间比较采用 LSD-t 检验，以P0.05 表示组间差异有统计学意义。2 结果2.1 雷公藤甲素可激活小鼠肝细胞自噬尾静脉高压注射 GFP-LC3 质粒的小鼠，经小剂量雷公藤甲素暴露后，GFP-LC3 主要聚集在肝区（图 1-A），肝细胞内可探测到由于 GFP-LC3 聚集而显现出的绿色荧光，且随给药时间增加强度加大（图 1-B，图 1-C），说明雷公藤甲素可诱导 LC3向肝脏聚集，为自噬的发生奠定基础。肝组织蛋白 Western blot结果显示，随着雷公藤甲素作用时间的增加，LC3-II 的表达量呈增加趋势（图 1-D），表明雷公藤甲素可以激活肝细胞自噬。而 P62 蛋白的表达量在雷公藤甲素的诱导下，呈先降低后升高的趋势（图 1-D），提示雷公藤甲素低剂量暴露时能诱导激活肝细胞自噬，而高剂量暴露会造成 P62 的累积，阻碍自噬体的清除。2.2 雷公藤甲素影响 LC3 和 P62 蛋白在肝细胞中的共定位为了探明雷公藤甲素诱导的肝细胞自噬体能够被有效降解，我们应用荧光显微镜和活细胞工作站观察了 LC3 和 P62蛋白在细胞内的共定位，P62 阳性表达呈红色荧光，LC3 阳性表达显绿色荧光，若二者共定位则呈现黄色荧光。结果显示：溶剂对照组，细胞质内能观察到 P62 和 LC3 的荧光，提示 P62 质粒转染成功，LC3 稳转细胞系表型正常（图 2 A）。经 10nM、25nM、50nM、100nM 雷公藤甲素孵育后，L02 细胞内出现明显的黄色荧光，提示 P62 和 LC3 存在共定位（图 2 BF）。用 50nM 雷公藤甲素孵育 L02 细胞，活细胞工作站动态观察发现，雷公藤甲素能诱导肝细胞内红色荧光和黄色荧光在短时间内显著增高，标记 P62 蛋白的红色荧光强度短暂增加，120 min 时消失。且显示 P62 和 LC3 共定位的黄色荧光随时间增加亦呈减弱趋势（图 2 G1G6）。3 讨论自噬是一种溶酶体依赖型的细胞内降解系统。正常情况下，基础水平的自噬通过 self-eating 行为清除细胞内错误折叠的蛋白质、受损的细胞器等而维持细胞内的稳态9,10。而在应激状态下，自噬可表现出 双面性：如在缺氧、中毒等条件下，肝细胞可通过自噬阻止细胞凋亡及坏死，以及在由刀豆球蛋白A 诱导的小鼠急性肝损伤模型中，自噬又可促进细胞凋