枯草芽孢杆菌细菌素研究进展_范修强.pdf

Hunan Animal Science and Veterinary Medicine,No.6,2022.（Total No.232）2022 年第 6 期（总第 232 期）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是芽孢杆菌属的一种，为革兰氏阳性需氧菌，广泛分布在土壤及腐败的枯草等有机物中。该菌无荚膜、有鞭毛，菌落表面粗糙,呈白色或微黄色。菌体生长速度快,对营养要求较低，在普通碳源培养基中生长良好，在工业生产条件下保持较好的活力。在生殖生长期，幼龄 B.subtilis 能产生大量芽孢，在生长环境恶劣、营养物质缺乏等不适宜的环境下进入孢子休眠期，形成抗逆、耐高温、耐酸碱等抗性作用。在环境适宜生长条件下，芽胞会重新生长为 B.subtilis1。B.subtilis是一种重要的益生菌种，不含内毒素和无致病性，能够产生多种抗菌活性物质，还能够分泌淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、和纤维素酶等多种内源酶，被美国 FDA 认定为“Generally regarded as safe”（GRAS）级别益生菌种，在医药、食品、农业、畜牧业、水环境改善等方面用途很广2。B.subtilis 在中国现已作为益生菌被批准为饲料添加剂。此外，该菌无显著的密码子偏爱性，适于作为“细菌工厂”生产外源重组蛋白。1945 年首次发现 B.subtilis 可以产生抗菌活性物质3，至今已发现 B.subtilis 能产生几十种不同分子结构的抗生素（antibiotics），包括由核糖体合成的多肽（又称为 Bacteriocins，细菌素）、非核糖体的多肽合成酶催化形成的多肽以及非肽类化合物（包括聚酮类化合物、磷脂类化合物等）。多肽类抗生素是B.subtilis 最主要的抗菌物质，细菌素抗菌谱较窄，主要抑制与自身种属较密切的细菌；而非核糖体合成的多肽具有广谱抑制细菌和真菌的活性4。随着基因组学的快速进展，新的细菌素正在不断被认知，是传统抗生素的有前途的替代品。与非核糖体合成的代谢产物相比，由核糖体合成的细菌素更易于经基因工程等分子生物学技术进行生产。文章主要概述了枯草芽孢杆菌产生细菌素的研究进展，旨在为细菌素（基因）的开发应用提供理论依据。1枯草芽孢杆菌细菌素的分类在革兰氏阳性菌中，芽孢杆菌属是一个十分多样的菌属，具有 200 多个亚种5。芽孢杆菌属产生的细菌素具有不同的分子大小、序列、结构和抗菌活性，其分类与乳酸菌细菌素分类不同。芽孢杆菌细doi:10.3969/j.issn.1006-4907.2022.06.016枯草芽孢杆菌细菌素研究进展范修强，喻家晓，刘 峰，汪招雄，张明辉，高学军（长江大学 动物科学学院，湖北 荆州 434023）摘要：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是“Generally regarded assafe”（GRAS）级别益生菌种，在医药、食品、农业、畜牧业、水环境改善等方面用途很广。文章介绍了 B.subtilis 由核糖体合成的多肽（Bacteriocins，细菌素）的研究进展，包括其分类、结构特征、作用机理和抑菌谱，对基因组组成和 Bacteriocins基因簇结构特征进行了简介，并对 B.subtilis 及其 Bacteri-ocins的进一步开发利用进行了展望，为相关科研工作者提供参考依据。关键词：枯草芽孢杆菌；细菌素；分类；作用机理；基因簇中图分类号：S816.7文献标识码：A文章编号：1006-4907（2022）06-0047-04Research progress on bacteriocins produced by Bacillus subtilisXiuqiang Fan,Jiaxiao Yu,Feng Liu,Zhaoxiong Wang,Minghui Zhang,Xuejun Gao(College of Animal Science,Yangtze University,Jingzhou 434023,PRC)Abstract:Bacillus subtilis is a Generally Regarded as Safe(GRAS)probiotic strain,which is widely used in medicine,food,agriculture,animal hus-bandryand water environment improvement.This paper introduced the research progress ofribosomal synthesized small peptides with antimicrobial activi-ty(Bacteriocins)in B.subtilis,including their classification,structural characteristics,mechanism of action and antimicrobial spectrum.The genome basecompositions ofB.subtilis and the bacterocin gene clusters were alsointroduced.The further development and utilization of B.subtilis and its bacteriocinswere alsoprospected.This reviewwould provide reference for relevant scientific researchers.Key words:Bacillus subtilis;Bacteriocin;classification;mechanism;Gene cluster基金项目：长江大学动物科学学院武汉大北农农牧发展有限公司联合培养研究生项目（2022）。作者简介：范修强（1997），男，兽医专业硕士，研究方向:动物产品性状形成机理和调控技术，。通信作者：高学军，E-mail:。专论与综述47Hunan Animal Science and Veterinary Medicine,No.6,2022.（Total No.232）2022 年第 6 期（总第 232 期）菌素依据分子结构特征，不同细菌产生的细菌素被分为 3 类（）5-7。类细菌素，又称为羊毛硫细菌素（lantibiotics），为小分子阳离子多肽（30kDa）的没有修饰的蛋白质，对热不稳定，例如 megacin A-216。2 枯草芽孢杆菌细菌素的结构特征、作用机理和抑菌谱多数 B.subtilis 细菌素具有类似的结构特征，因此也具有类似的分子机理和抑菌谱。多数 B.subtilis 细菌素具有多肽链 N-端具有带有正电荷的亲水基团，能够结合细菌细胞膜的磷脂，当这一结合发生后，疏水的 C-端区域能够穿透至疏水的细胞膜内部，使细胞膜形成穿孔而导致细胞死亡5。.3 亚类由 2 种多肽形成，这 2 种多肽的基因在同一操纵子中彼此相邻，2 种多肽以 1：1 的比例共同形成一种膜穿透螺旋-螺旋结构6。B.subtilis 细菌素主要抑制革兰氏阳性菌包括其他芽孢杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等，其抑制机理在于这些革兰氏阳性菌具有细菌素能够结合的含肽聚糖的细胞壁，而革兰氏阴性菌不具有细菌素能够结合的相应细胞壁结构5,8,9。B.subtilis 细菌素是天然合成的，具有热稳定性、耐强碱、水溶性好、抗菌谱广、抗菌活性高、不易产生耐药性等特点10,11。细菌素 subtilin 是 B.subtilis ATCC 6633 产生的最有效的 lantibiotic 细菌素，研究工作也最全面和深入5,9。以下以 subtilin 为例，说明枯草芽孢杆菌细菌素的结构特征、作用机理和抑菌谱。Subtilin多肽链具有 56 个氨基酸残基，结构分为 24 个氨基酸残基的 N-端前导肽（leader peptide）序列和 32 个氨基酸残基的 C-端核心肽（core peptide）序列 2 个部分。前导肽（leader peptide）序列不含 Cys 残基，与细菌素分泌到细胞外有关，在其分泌至细胞外时被切除。核心肽含有 Ser、Thr 和 Cys 氨基酸残基，是lanthionine 和 methyllanthionine 硫醚环形成所需要的。Ser 和 Thr 分别脱水生成 2,3-二氢丙氨酸（2,3-didehydroalanine，Dha）和 2,3-二氢氨基丁酸（2,3-didehydrobutyrine，Dhb），Dha 和 Dhb 与 Cys 的巯基反应，使肽链形成环状结构（图 1）9。这样的分子结构使得 subtilin 能够结合细胞壁发挥作用，并且分子结构具有耐热、耐酸碱等特征。Subtilin 能够靶向细胞壁的前体物 lipid II 的焦磷酸杆菌烯基抑制肽聚糖（peptidoglycan）的组装，使敏感细菌细胞膜形成穿孔和透性化导致具体死亡12。Subtilin 与 nisin类似，对革兰氏阳性菌具有广谱的抑制作用，如抑制其他芽孢杆菌属菌株、乳球菌属（Lactococcusspp.）和藤黄微球菌（Micrococcus luteus），其对 M.luteus 菌株 NDCO8166 的最小抑制浓度（minimalinhibitory concentration，MIC）为 0.05g/mL5,9。3 枯草芽孢杆菌细菌素的基因簇3.1 枯草芽孢杆菌基因组简介早在 1997 年，已完成模式菌 B.subtilis168 的全基因组 DNA 序列测定（登录号 AL009126）13。近几年近百个 B.subtilis 亚种（或菌株）的全基因组 DNA序列测定业已完成，提供了更多的 B.subtilis 细菌素专论与综述（改编自Mercado和Olmos，20226）图 1 Subtilin（核心肽）分子结构示意图48Hunan Animal Science and Veterinary Medicine,No.6,2022.（Total No.232）2022 年第 6 期（总第 232 期）（引自Lee和Kim，20118）图 2 Subtilin 基因簇的具体结构示意图基因簇的信息。例如，Bacillus subtilisMJ01 染色体基因组大小为 4108293 bp，其中有 4269 个编码序列14。B.subtilisN2-20 基因组大小为 4036899bp，含有 4163 个编码序列，在抗菌物质合成方面，N2-20含有 10 个基因簇、168 菌株含有 11 个基因簇15。B.subtilisCGMCC 12426 完整基因组序列由 1 个环形的4138265bp 的染色体与1个74165 bp 的质粒组成，共编码 4222个编码序列16。在B.subtilis基因组中，与抗菌代谢产物合成相关的基因总共达到基因组的 4-5%。近年来通过基因组挖掘和蛋白分离纯化，新发现一些 B.subtilis 细菌素，例如：BAC-IB1717，mejucin18，Subtilin L-Q1119等。还有很多新发现的细菌素，尚不清楚其具体分子结构、编码基因或编码相应合成酶的基因以及分子作用机理，这些细菌素被称为细菌素 样 抑 制 物 质（bacteriocin-like inhibitory substances，BLIS）6。尚有很多编码序列的多肽产物依据序列特征被预测为细菌素，有待实验证实。3.2细菌素基因簇结构特征大部分细菌素的基因和相关基因以基因簇的形式存在，包括细菌素结构基因、负责转运细菌素转运的基因、细菌素自身免疫基因（保护细菌不被自身的细菌素所破坏）、细菌素表达调节基因、细菌素加工成熟所需酶类基因。细菌素结构基因表达产物为带有 N-端信号肽的未成熟蛋白，在运输到细胞外时信号肽被细菌产生的酶所切除8。细菌素的基因簇具有相似的结构，以下以 subt