苦参碱对胰腺癌吉西他滨耐药细胞化疗敏感性的影响_郭晨博.pdf

2022 年 12 月第 30 卷 第 8 期中国实验动物学报ACTA LABORATORIUM ANIMALIS SCIENTIA SINICADecember 2022Vol.30 No.8郭晨博,毛玉宁,张贺,等.苦参碱对胰腺癌吉西他滨耐药细胞化疗敏感性的影响 J.中国实验动物学报,2022,30(8):1042-1049.Guo CB,Mao YN,Zhang H,et al.Effect of matrine on pancreatic cancer cell chemosensitivity to gemcitabine J.Acta Lab Anim Sci Sin,2022,30(8):1042-1049.Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2022.08.004基金项目国家自然科学基金(31772546),陕西省创新能力支持计划(2021PT-037),军队实验动物专项课题(SYDW201801)。Funded by National Natural Science Foundation of China(31772546),Shaanxi Innovation Ability Support Program(2021PT-037),Special Topics on Laboratory Animals in the Army(SYDW201801).作者简介郭晨博(1995),男,在读硕士研究生,研究方向:肿瘤的生物学性状及中医药防治基础研究。Email:821962209 通信作者 师长宏(1973),男,教授,研究方向:人类疾病动物模型。Email:changhong ;汪永锋(1967),男,教授,研究方向:医学解剖学研究。Email:wyf 。共同通信作者苦参碱对胰腺癌吉西他滨耐药细胞化疗敏感性的影响郭晨博1,2,毛玉宁2,张贺2,张彩勤2,张延英1,汪永锋1,师长宏2(1.甘肃中医药大学,兰州 730030;2.空军军医大学实验动物中心,西安 710032)【摘要】目的 探索苦参碱在胰腺癌吉西他滨(GEM)耐药中的作用,以期为恢复胰腺癌化疗敏感性提供新的治疗手段。方法选择胰腺癌细胞系 AsPC-1,使用吉西他滨诱导构建胰腺癌吉西他滨耐药细胞株 AsPC-1-GEM,通过 CCK-8 实验测试其耐药性,检测细胞活力分析苦参碱对胰腺癌吉西他滨耐药细胞株的作用;进一步通过RT-PCR 和 Western Blot 检测耐药前后多药耐药蛋白 2(ABCG2)的表达变化以及苦参碱对 ABCG2 的影响;利用裸鼠建立胰腺癌吉西他滨耐药细胞系异种移植模型,观察使用苦参碱治疗后肿瘤体积的变化;通过免疫组化检测苦参碱对 ABCG2 表达的影响。结果 耐药细胞 AsPC-1-GEM 中 ABCG2 表达增高(P 0.01),苦参碱可有效降低耐药细胞 ABCG2 的表达(P 0.01),提高胰腺癌吉西他滨耐药细胞的敏感性(P 0.01)。体内实验进一步验证了苦参碱治疗可降低 ABCG2 的表达(P 0.01),并减缓肿瘤生长(P 0.01)。结论 苦参碱通过降低 ABCG2 的表达,提高胰腺癌吉西他滨耐药细胞株的敏感性。【关键词】胰腺癌;苦参碱;吉西他滨;耐药【中图分类号】Q95-33 【文献标识码】A 【文章编号】1005-4847(2022)08-1042-08Effect of matrine on pancreatic cancer cell chemosensitivity to gemcitabineGUO Chenbo1,2,MAO Yuning2,ZHANG He2,ZHANG Caiqin2,ZHANG Yanying1,WANG Yongfeng1,SHI Changhong2(1.Gansu University of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730030,China.2.Laboratory Animal Center,Air Force Military Medical University,Xian 710032)Corresponding author:WANG Yongfeng.E-mail:wyf ;SHI Changhong.E-mail:changhong 【Abstract】Objective To explore the effects of matrine on gemcitabine(GEM)resistance in pancreatic cancer and to provide a new therapeutic strategy for restoring the chemosensitivity of pancreatic cancer cells.MethodsThe pancreatic cancer cell line AsPC-1 was selected and GEM resistance induced by treatment with gemcitabine.The drug-resistant cell line AsPC-1-GEM was established and confirmed by CCK-8.The effect of matrine on AsPC-1-GEM was analyzed by detecting the cell viability.Expression changes to multidrug resistance protein 2(ABCG2)and the effect of matrine on ABCG2 were further tested using RT-PCR and Western Blot.We further established a GEM-resistant cell line xenograft model of pancreatic cancer in nude mice and observed the changes in tumor volume after treatment with matrine.The effect of matrine on the expression of ABCG2 was detected by immunohistochemistry.Results ABCG2 expression was 中国实验动物学报 2022 年 12 月第 30 卷第 8 期 Acta Lab Anim Sci Sin,December 2022,Vol.30,No.8increased in GEM-resistant AsPC-1 cells(P 0.01),and matrine significantly reduced ABCG2 expression(P 0.01)and improved the sensitivity of AsPC-1-GEM cells(P 0.01).Treatment with matrine reduced the expression of ABCG2(P 0.01)and retarded tumor growth(P 0.01)in the xenograft models with AsPC-1-GEM tumors.Conclusions Matrine increases the sensitivity of GEM-resistant pancreatic cancer cell lines by decreasing the expression of ABCG2.【Keywords】pancreatic cancer;matrine;gemcitabine;resistanceConflicts of Interest:The authors declare no conflict of interest.胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是最致命的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率分别位于恶性肿瘤的第七位和第六位1-2,近几年的发病率呈上升趋势3。目前手术切除仍是 PC 患者唯一可能治愈的手段,但由于 PC 早期缺乏临床症状和体征,直到晚期才被发现,导致手术效果不佳4。虽然近几年免疫疗法在 PC 治疗方面取得了一定进展,但仍然具有一定的局限性,因此化疗依旧是 PC 治疗的最主要手段之一5。吉西他滨(gemcitabine,GEM)是治疗 PC的一线化疗药物6,但是由于对吉西他滨的耐药性,导致治疗效果并不显著,因此急需深入研究吉西他滨耐药的机制,增强其敏感性7。近年来研究发现 ATP 结合盒(ATP binding cassette,ABC)转运体的过表达与肿瘤耐药相关8。ABC 转运体是一种介导 ATP 驱动转运的膜蛋白家族8。多药耐药蛋白 2(the ATP-binding cassette ABC superfamily gmember 2,ABCG2)是 ABC 膜蛋白家族成员之一,研究发现 ABCG2 通过降低细胞内药物浓度以显著增加化疗药物耐药性9,但其在胰腺癌吉西他滨耐药中的作用并不明确,因此将 ABCG2 作为改善胰腺癌吉西他滨耐药的治疗靶点9。大部分针对特定基因的分子抑制剂只能延迟癌症的进展,癌细胞最终将通过激活替代途径获得对抑制剂的耐药性。与传统的治疗抑制剂相比,中药单体具有低毒性、高安全性的特点,在改善肿瘤细胞耐药性中发挥着重要的作用。研究表明苦参碱具有改善肿瘤耐药的作用。苦参碱(matrine,MT)是从豆科植物苦豆子的根和茎中分离得到的一种天然生物碱10-11。具有诱导细胞凋亡和自噬、抑制细胞增殖、侵袭、转移与 EMT 过程,逆转耐药,细胞周期阻滞等生物学功能,因其高生物活性而被广泛发展为多种制剂12。研究发现苦参碱在改善胃癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌13-18耐药中发挥着重要的作用。目前苦参碱在胰腺癌吉西他滨耐药中的作用并不清楚,并且是否调控 ABCG2 的表达不明确。本研究旨在研究苦参碱在胰腺癌耐药中的作用,探索其调控机制。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物20 只 SPF 级雄性 BALB/c 裸鼠,6 7 周龄,体重 22 25 g,购买自成都药康生物科技有限公司【SCXK(川)2020-034】。环境温度 23 25,相对湿度 40%,光照/黑暗各 12 h,昼夜交替;动物自由摄食和饮水,饲养于空军军医大学实验动物中心SPF 级屏障设施中【SYXK(陕)2019-001】。细胞异种移植模型分为对照组、苦参组、吉西他滨组、苦参碱和吉西他滨联合组,每组 5 只裸鼠。相关动物实验通过空军军医大学实验动物福利伦理委员会批准(IACUC-20220427)。1.1.2 细胞人类胰腺癌细胞系 AsPC-1 购自国家细胞库-ATCC 细胞资源中心。1.1.3 主要试剂与仪器苦参碱购自上海源叶生物科技有限公司,DMEM 培养基和胎牛血清均购自美国 Gibco 公司;0.05%胰酶购自美国 HyClone 公司;荧光定量 PCR及 RNA 提取试剂盒等酶标仪(Biotek Take,美国),CCK-8 检测试剂盒购自上海七海复泰生物科技有限公司;吉西他滨购自 ELI LILLY 公司。酶标仪(Bio Tek,美国),超净工作台(Thermo Fisher Scientific,美国),显微镜(Olympus,日本),普通离心机(安徽中佳科学仪器有限公司,中国),恒温水浴锅(上海三发科学仪器有限公司,中国)。1.2 方法1.2.1 细胞培养AsPC-1 细胞用培养基为含有 10%FBS 及青霉素(100 IU/mL)/链霉素(100 g/mL)的 DMEM,在5%CO2的 37恒温培养箱中培养。1.2.2 诱导吉西他滨耐药胰腺癌细胞株采用 96 孔板分不同浓度的吉西