兰州百合多糖的酶解工艺及其体外抗氧化活性研究_惠和平.pdf

2022 年第 12 期摘要：以兰州百合多糖为原料，采用 -甘露聚糖酶进行酶解，通过单因素试验与 L9（33）正交试验研究底物质量分数、酶添加量、酶解时间对还原糖生成量的影响，优化得出最佳工艺条件；同时以维 C 为对照，运用 DPPH、ABTS 自由基、羟自由基和超氧自由基试验来评价兰州百合多糖酶解产物的抗氧化活性。结果表明，兰州百合多糖的最佳酶解工艺为底物质量分数 0.2%，酶添加量 0.5%，酶解时间 4 h，在此条件下还原糖的生成量为 0.806 20.008 4 mg/mL。所得酶解产物对 4 种自由基的清除能力在试验浓度范围内均强于未经酶解兰州百合多糖的清除能力，且呈一定的质量浓度依赖关系。当质量浓度为 4 mg/mL 时，兰州百合多糖对羟自由基的清除率为 69.16%，酶解后产物对羟自由基的清除率达 92.18%，接近于阳性对照维 C。酶解提高了兰州百合多糖的抗氧化活性。关键词：兰州百合；多糖；酶解工艺；抗氧化活性中图分类号：TQ461；R284.2文献标志码：Adoi：10.16693/ki.1671-9646（X）.2022.12.036Study on the Enzymatic Hydrolysis of Lanzhou Lily Polysaccharide andits Antioxidant Activity in VitroHUI Heping1，WANG Ping1，ZHANG Xinchi2，CAI Wei1，LI Xiaodong3，LI Guannan1，LIU Yingnan1（1.Gansu Vocational College of Agriculture，Lanzhou，Gansu 730020，China；2.School of Pharmacy，Gansu University ofTraditional Chinese Medicine，Lanzhou，Gansu 730010，China；3.Gansu Hospital of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou，Gansu 730050，China）Abstract：Using Lanzhou lily polysaccharide as raw material，it was hydrolyzed by-mannanase.The effects of substrate con-centration，enzyme dosage and hydrolysis time on the yield of reducing sugar were studied by single factor test and L9（33）or-thogonal test，and the optimal technological condition was obtained.Meanwhile，the DPPH，ABTS free radical，hydroxylradical and superoxide radical experiments were conducted to evaluate the antioxidant activity of the enzymatic hydrolysis prod-ucts of Lanzhou lily polysaccharide，with VC as the control.The results showed that the optimal enzymatic hydrolysis conditionwas substrate concentration 0.2%，enzyme dosage 0.5%，and enzymatic time 4 h.Under these conditions，the yield of reduc-ing sugar was 0.806 20.008 4 mg/mL.The scavenging ability of the obtained enzymatic hydrolysis products to the four freeradicals was stronger than that of un-enzymatic hydrolyzing Lanzhou lily polysaccharide in the experimental concentrationrange，and the scavenging ability was in a certain concentration-dependent manner.When the concentration was 4 mg/mL，the scavenging rate of un-enzymatic hydrolyzing Lanzhou lily polysaccharide to hydroxyl radicals was 69.16%，and the scav-enging rate of products after enzymatic hydrolysis to hydroxyl radicals was 92.18%，which was close to the positive control VC.Enzymatic hydrolysis enhanced the antioxidant activity of Lanzhou lily polysaccharide.Key words：lanzhou lily；polysaccharide；enzymatic hydrolysis process；antioxidant activity兰州百合多糖的酶解工艺及其体外抗氧化活性研究惠和平1，王萍1，张心驰2，蔡伟1，李晓东3，李冠男1，刘颖楠1（1.甘肃农业职业技术学院，甘肃 兰州730020；2.甘肃中医药大学 药学院，甘肃 兰州730010；3.甘肃省中医院，甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州730050）收稿日期：2022-06-29基金项目：甘肃省高等学校创新基金项目（2021A-260）；国家自然科学基金项目（82160818）。作者简介：惠和平（1982），男，博士，副教授，研究方向为药用植物中有效成分的分离纯化、结构鉴定与活性评价。兰州百合（Lilium davidii var.unicolor Salisb.）为百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）多年生草本球根植物1，主要分布在我国甘肃省兰州市七里河地区。作为我国西部地区大面积种植的食用百合，其鳞茎硕大、鳞片丰满、口感甘甜，名列食用百合之首。兰州百合始载于 神农本草经 2，具有较高的营养价值和药用价值，富含 19 种游离氨基酸和多种人体必需的微量元素，其蛋白含量是普通蔬菜的 35 倍，糖含量是普通蔬菜的 10 倍3。现代药理学研究表明，兰州百合多糖具有明显的增强免疫、抗疲劳、抗癌、提高耐缺氧等作用4-7。近年来，天然源多糖因其生物活性丰富、无毒、文章编号：1671-9646（2022）12b-0023-06第 12 期（总第 566 期）农产品加工No.122022 年 12 月Farm Products ProcessingDec.农产品加工2022 年第 12 期生物可降解和生物相容性等而备受关注8-10。然而，大部分多糖的生物活性受到其理化性质和结构的影响，如分子量大、黏度高，水中溶解度低及结构复杂等问题，其开发和利用受到一定的限制。国内外报道8，11-13显示兰州百合多糖为杂多糖，含有-1,4-葡糖糖、-1,4-甘露糖和-1,3-半乳糖等多种连接类型，结构复杂，分子量大（10 万左右），黏度达81.698 cm3/g，这也导致兰州百合多糖的应用受限。有研究表明，多糖的活性中心可能是其中某几个多糖片段或寡糖14-16，而降解多糖是目前获得分子量低、水溶性好、结构简单的高活性多糖片段或寡糖的主要手段。酶解法，作为目前多糖降解的常用方法，具有专一性强、反应迅速、条件温和、得率高等优点，且能最大程度地保护反应底物的活性基团17-19。如李科等人20采用内切-1,4-葡聚糖酶酶解黄芪多糖，获得了不同聚合度的寡糖组分，并且发现聚合度在1018 之间的寡糖活性强于多糖，可能为黄芪多糖的活性中心。Wu Q 等人21运用响应面法优化了纤维素酶对黑木耳多糖的酶解，在获得最佳酶解工艺的条件下发现酶解后黑木耳多糖具有更好的抗氧化活性。杨玲22采用 -甘露聚糖酶酶解仙茅多糖，通过纯化得到仙茅寡糖 XP1XP5，并且发现三聚葡甘露寡糖XP3 保留了仙茅寡糖的活性基团，其诱导巨噬细胞分泌 IL-1 的能力高于仙茅多糖 X-2。-甘露聚糖酶可以选择性降解 1,4-连接的甘露葡聚糖和甘露聚糖等22，而兰州百合多糖主要由 1,4-D-吡喃甘露糖和葡萄糖组成。截至目前，没有关于酶降解兰州百合多糖的报道。因此，采用 -甘露聚糖酶降解兰州百合多糖，通过正交试验得到最佳酶解工艺，并对酶解前后兰州百合多糖的抗氧化活性进行了比较研究，以期为兰州百合多糖活性片段的制备及其高值化利用提供可行的技术路线和试验依据。1材料与方法1.1材料与试剂百合，购自甘肃省兰州市七里河区上西园种植户，经兰州大学药学院马志刚教授鉴定为兰州百合（Lilium davidii var.unicolor Salisb.）。-甘露聚糖酶（6104U/g），北京 Solarbio 生物科技有限公司提供；1,1-二苯基-2-苦基肼基（DPPH），（分析纯 98%），上海源叶生物科技有限公司提供；2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS），（分析纯98%）、葡萄糖标准品，（分析纯99%），美国 Sigma 公司提供；3,5-二硝基水杨酸（DNS），（分析纯 98%）、焦性没食子酸，（分析纯 99%），上海麦克林生化科技有限公司提供；过硫酸钠，（分析纯98%），天津市科密欧化学试剂有限公司提供；水杨酸、过氧化氢、七水硫酸亚铁，国药集团化学试剂有限公司提供，（分析纯99%）。1.2仪器与设备DF-101S 型集热式磁力加热搅拌器、DZF-6050型电热真空干燥箱、RE-2000A 型旋转蒸发仪、DF-101S 型恒温水浴锅，上海耀特仪器设备有限公司产品；SCIENTZ-10N 型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；AnkeGL-16G-II 型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器有限公司产品；UV-2800A 型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司产品。1.3试验方法1.3.1兰州百合多糖的酶解工艺流程兰州百合捣碎80%乙醇回流脱脂滤渣抽干热水提取70%乙醇沉淀离心取沉淀冻干兰州百合多糖加水溶解Sevag 法脱蛋白浓缩冻干-甘露聚糖酶酶解灭酶过滤取上清液浓缩透析冷冻干燥即得。1.3.2还原糖标准曲线的制作精密称取葡萄糖标准品 100 mg，加水定溶于100 mL 容量瓶中。分别精密吸取葡萄糖溶液 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.2 mL 于 25 mL 容量瓶中，补蒸馏水至 2 mL，分别加入 3 mL DNS 溶液，混合均匀后，90 水浴加热 7 min，取出后迅速冷却至室温，加蒸馏水定容至刻度，摇匀放置 30 min，于波长540 nm 处检测吸光度。以吸光度（Y）为纵坐标，葡萄糖质量浓度（X）为横坐标绘制还原糖的标准曲线，得出回归方程为 Y=1.296 8X-0.049 5，相关系数R2=0.996 1。1.3.3单因素试验取 1.0 g 兰州百合多糖为原料，在 -甘露聚糖酶的最适温度（50 ）和最适 pH 值（pH=4.8）条件下，考查底物质量分数、酶添加量和酶解时间对还原糖质量浓度的影响。首先，固定酶添加量 0.3%，酶解时间 3 h，考查底物质量分数（0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%）对还原糖生成量的影响，确定底物质量分数的试验水平