昆明裂腹鱼CYP1A1基因结构与进化分析_毕映慧.pdf

SCI-TECH INNOVATION&PRODUCTIVITYNo.1 Jan.2023，Total No.348昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因结构与进化分析基金项目 国家级大学生创新项目（202010666016）；贵州省大学生创新项目（S202010666081；S202110666212）；贵州省科技厅基础项目（黔科合基础 2018 1166）；兴义民族师范学院州管专家项目（21XYZJ 02）收稿日期：20220511；修回日期：20220623作者简介：毕映慧（2000），女，山西阳泉人，在读本科，主要从事生物遗传学研究，E-mail：。通信作者：苗贵东（1973），男，山东临沂人，理学博士，教授，主要从事分子遗传学研究，E-mail：。毕映慧，苗贵东，杨申才，吕彤彤，杨进摘要：通过构建昆明裂腹鱼全长转录组文库获得基因全长，并通过设计引物 PCR 扩增，验证高通量测序的准确性，同时对 CYP1A1 基因的 CDS 序列进行基因结构和生物信息学分析。结果表明：昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因的 CDS 序列为1 498 bp，编码 299 个氨基酸，与鲤鱼、安水金线鲃、鲫鱼的 CDS 序列的同源性相似比率分别为 91.70%、92.23%、91.63%，氨基酸序列同源性相似比率分别为 90.55%、90.16%、89.76%，昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因的氨基酸的相对分子质量为 55 867.48 KD，理论等电点（pI）为 6.44，分子式为 C2505H3965N671O728S23；分子系统进化树分析表明，与金线鲃、犀角金线鲃和安水金线鲃亲缘关系相近，与斑马鱼亲缘关系较远；昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因存在明显的疏水性区域，有1 个信号肽、27 个磷酸化位点、2 个跨膜区、有 1 个 N-糖基化位点，3 个 O-糖基化位点；二级结构主要以-螺旋为主，无规则卷曲次之，-折叠最少；三级结构分析表明，昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因有 1 个缺失突变位点，6 个 Cys 位点。该研究为进一步研究昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因的功能奠定了基础。关键词：昆明裂腹鱼；细胞色素 P450 基因；基因结构；进化分析中图分类号：Q959.46+8；Q343.1+2；Q754文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1674-9146.2023.01.026（兴义民族师范学院生物与化学学院，贵州兴义562400）文章编号：1674-9146（2023）0102608昆明裂腹鱼已成为我国重要的经济养殖鱼类之一1，属鲤科（Cyprinidae）裂腹鱼属（SchizothoraxHecke），地方名常称之为细鳞鱼2，主要生活在我国的西南部分地区，贵州省境内主要生活在南盘江、北盘江上游的支流中，此外金沙江下游、乌江上游等都有分布。昆明裂腹鱼的最适生长水温范围在 1418 之间，为冷水性鱼类，由于具有较强的耐低温能力以及肉味鲜美的优点，因此具有开发养殖前景，已被列入贵州省“十四五”乡村振兴生态渔业产业重要的经济鱼种。然而，昆明裂腹鱼存在性成熟时期较晚（一般雌性鱼 4 龄、雄性鱼 3 龄的个体性腺才开始逐渐发育成熟）、繁殖能力较低、生长畸形率较高3等困扰产业发展的问题。细胞色素 P450（Cytochrome P450，CYP450）由一群基因超家族（super family）编码的酶蛋白所形成。CYP450 在生物体内广泛分布，是微粒体混合功能氧化酶中不可或缺的一族氧化酶。CYP450与雌激素在内的外源性以及内源性化学物质在生物体内的相互转化是依赖于酶来实现的。在雌激素致癌链上，雌激素代谢酶的活性以及功能会对雌激素与靶细胞的作用产生直接影响2。研究表明 CYP450就包括了 CYPlAl、CYP1B1 以及 CYPl9 等。细胞色素 P4501A1（Cytochrome P4501A1，CYP1A1）是一种芳香烃羟化酶4，是一种重要的体内 I 相代谢解毒酶，能对多种环境致癌物以及突变物进行失活5。许多研究表明，CYP1A1 是一种重要的激活环境污染物（多环芳香碳氢化合物）的酶6-7。通过开展发育调控及性别控制相关基因研究，进一步研究其功能，为认识昆明裂腹鱼的发育特点及性别控制相关育种研究奠定理论基础。1实验材料与方法本研究材料昆明裂腹鱼个体取自中国科学院昆明动物研究所云南濒危物种保育中心，通过解剖取雌雄成熟个体性腺，构建了雌雄个体的全长转录组文库，并进行高通量测序。取鱼鳍，用 95%酒精脱水，-20 保存。通过对昆明裂腹鱼全长转录组文库数据分析与挖掘，获得昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因的全长，设计引物，然后通过 PCR 扩增产物直接测序方法，验证 CYP1A1 基因的全长。2实验结果2.1昆明裂腹鱼基因组 DNA提取取适量鱼鳍组织，采用天根生物海洋动物组织*创新 思 维Innovative Thinking-026-2023 年 1 月总第 348 期基因组提取试剂盒，按照试剂盒方法提取高质量基因组 DNA，-20 保存备用。基因组 DNA 经检测，DNA 琼脂糖凝胶电泳检测结果图显示主条带清晰，点样孔干净无荧光，表明 DNA 质量良好，见图 1。图 1 中，M 为 D2000Marker。2.2昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因的全长测序验证对获得昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因的全长序列进行基因组扩增，PCR 扩增产物直接测序验证，获得序列与高通量测序所获基因序列进行比较，高通量测序所获基因序列的碱基准确性大于 99%，高通量测序所获基因序列结果较为可靠（见图 2、图 3）。图 2 中，M 为 D2000 Marker。2.3昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因结构分析根据整理的基因序列，采用美国国家生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI）网站上的 ORF Finder 程序，对测序获得的mRNA 序列进行开放阅读框定位；确定其起始密码子以及终止密码子位点；进而获得其 CDS 序列全长。昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因的 CDS 序列全长为1 498 pb。采用 DNASTAR 软件，把 CDS 序列碱基翻译成氨基酸序列，得到 499 个氨基酸。采用SMART 软件，对昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因的 CDS序列进行预测，发现其氨基酸的 45368 区域和382499 区域为 Pfam（见图 4），跨膜区可能在931 区域（见表 1）。表 1SMART 软件预测的昆明裂腹鱼蛋白结构数据运用 NCBI 网站上的 Blast 程序，对扩增获得的昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因与近源物种的同源性进行比对。昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因与鲤鱼、安水金线鲃、鲫鱼、犀角金线鲃、金线鲃、南亚野鲮、草鱼、卡特拉鱼、黑头呆鱼和斑马鱼等物种的CYP1A1 基因的 CDS 序列区的同源性比对结果，见表 2。表 2CYP1A1 基因的 CDS 序列区的同源性比对结果由表 2 分析可知，昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因与安水金线鲃和犀角金线鲃的同源性相似比率较高，均为 92.23%；其次与鲤鱼、鲫鱼、南亚野鲮、卡特拉鱼、草鱼和黑头呆鱼的同源性相似比率依次为0100200300400PfamPfamp450p450Pfam图 4SMART 软件预测的 CDS 序列蛋白质结构图 1 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测结果图图 2部分引物 PCR 扩增产物结果图 3CYP1A1 基因部分引物 PCR 扩增产物测序结果3-b测序结果 23-a测序结果 1名称起始终止E 值跨膜区931N/APfam:p450453682.210-58Pfam:p4503824997.910-30（）（）物种同源性相似比率Cyprinus carpio（鲤鱼）91.70Sinocyclocheilus anshuiensis（安水金线鲃）92.23Carassius auratus（鲫鱼）91.63Sinocyclocheilus rhinocerous（犀角金线鲃）92.23Sinocyclocheilus grahami（金线鲃）92.03Labeo rohita（南亚野鲮）89.28Ctenopharyngodon idella（草鱼）87.16Labeo catla（卡特拉鱼）89.20Pimephales promelas（黑头呆鱼）84.32Danio rerio（斑马鱼）82.12位置创 新 思维Innovative Thinking-027-SCI-TECH INNOVATION&PRODUCTIVITYNo.1 Jan.2023，Total No.348图 5CYP1A1 基因氨基酸序列的分子系统进化树91.70%、91.63%、89.28%、89.20%、87.16%、84.32%；与斑马鱼的同源性相似比率较低，为82.12%。CYP1A1 基因的氨基酸序列的同源性比对结果见表 3。表 3CYP1A1 基因的氨基酸序列的同源性比对结果由表 3 分析可知，昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因的氨基酸序列与鲤鱼的氨基酸序列同源性相似比率最高，为 90.55%；与安水金线鲃和犀角金线鲃的氨基酸序列同源性相似比率均为 90.16%；与南亚野鲮、和黑头呆鱼的氨基酸序列同源性相似比率为86.42%。可以推测，CDS 序列区和氨基酸序列的同源性比对结果显示，扩增得到的基因即为昆明裂腹鱼的CYP1A1 基因。运用 BioEdit 软件，对本次试验扩增获得的CYP1A1 基因的 CDS 序列进行碱基组成成分分析。CYP1A1 基因的 4 种碱基组成含量见表 4。由数据分析可知，CDS 序列的单链蛋白质的相对分子质量为 455 822.00 KD，双链蛋白质的相对分子质量为 911 589.00 KD；GC 含量为 53.60%，AT 含量为 46.40%。2.4昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因进化分析从 NCBI 网站的 GeBank 数据库里下载鲤鱼、安水金线鲃、鲫鱼、犀角金线鲃、金线鲃、卡特拉鱼、南亚野鲮、黑头呆鱼、草鱼和斑马鱼等同源性物种的 CYP1A1 基因氨基酸序列。采用 MEGA7.0软件里面 Phyrogeny 的 Neighbor-Joining Tree 程序，对该序列构建分子系统进化树（见图 5）。（）物种同源性相似比率Cyprinus carpio（鲤鱼）90.55Sinocyclocheilus anshuiensis（安水金线鲃）90.16Carassius auratus（鲫鱼）89.76Sinocyclocheilus rhinocerous（犀角金线鲃）90.16Sinocyclocheilus grahami（金线鲃）90.35Labeo rohita（南亚野鲮）86.42Ctenopharyngodon idella（草鱼）88.72Labeo catla（卡特拉鱼）88.19Pimephales promelas（黑头呆鱼）86.42Danio rerio（斑马鱼）86.61碱基数量/个物质的量分数/%A35123.43C40026.70G40326.90T34422.96表 4昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因的 CDS 序列 4 种碱基含量2.5昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因蛋白质预测与分析2.5.1昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因蛋白质疏水性分析运用 ExPASy 在线平台上的 ProtScale 程序，对扩增得到的 CYP1A1 基因的蛋白质进行疏水性分析，将蛋白质序列提交到该程序，由程序给出CYP1A1 基因的疏水性图谱（见第 29 页图 6），从而对其进行分析。分析图 6 疏水性图谱可知，最小值为-3.144，位于序列 214 位置上；最大值为 3.478，位于序列472 位置；昆明裂腹鱼 CYP1A1 基因序列的 N-端的 532 位置区域、192208 位置区域、322341 位置区域和 465479 位置区域表现为明显的疏水性，在其序列 N-端的 209218 位置区域表现为