类器官模型在结直肠癌研究中的应用_李志利.pdf

医学新知 2023 年 2 月第 33 卷第 1 期 New Medicine,Feb.2023,Vol.33,No.162https:/ 璐1，2，王玉婷1，黄楚月1，王安琪1，吕政融1，樊志敏1，21.南京中医药大学附属南京中医院肛肠中心（南京210022）2.江苏省中医肛肠疾病临床医学创新中心（南京210022）【摘要】类器官是近年来逐渐兴起的一种新型研究模型，在疾病发展、药物筛选、新药研发、个性化医疗等领域应用前景广阔。近年来，结直肠癌类器官模型已较为成熟，本文对结直肠癌研究中的常见模型及其类器官模型的构建与应用现状作一综述。【关键词】类器官；结直肠癌；肿瘤模型；结肠癌；直肠癌Application of organoid models in colorectal cancer research Zhi-Li LI1,Lu WANG1,2,Yu-Ting WANG1,Chu-Yue HUANG1,An-Qi WANG1,Zheng-Rong LYU1,Zhi-Min FAN1,21.Colorectal Disease Center of Nanjing Hospital of Chinese Medicine Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210022,China 2.Jiangsu Clinical Medicine Innovation Center of Traditional Chinese Medicine Anorectal Diseases,Nanjing 210022,ChinaCorresponding author:Zhi-Min FAN,Email:【Abstract】Organoid is a new research tool that has gradually emerged in recent years.They promise to have a broad application prospect in the fields of disease development,drug screening,new drug development,personalized medicine and other fields.Nowadays,the colorectal cancer organoid model has become relatively mature.is paper reviews the common models in colorectal cancer research and the construction and application of colorectal cancer organoids.【Keywords】Organoids;Colorectal cancer;Tumor model;Colon cancer;Rectal cancer近年来，我国结直肠癌发病率显著上升，预计 2022 年结直肠癌仍将是我国发病率和死亡率最高的五大癌症类型之一1。目前，结直肠癌的临床治疗多以手术为主，辅以放化疗等。但患者耐药性的出现导致化疗敏感性呈逐渐降低趋势，且部分患者在确诊时已属中晚期，错过手术时机或术后复发转移，只能予以姑息治疗。因此，结直肠癌的基础研究与临床诊疗技术水平亟待提高，传统的研究模型已无法满足目前日益增长的临床诊疗需求。类器官模型是利用 3D 培养技术将干细胞或器官祖细胞在体外培养，通过添加特定的细胞外基质类似物和细胞因子定向诱导，形成与来源器官结构类似的细胞组织2。作为一种新型的研究模型，它的出现为癌症研究开辟了新的道路。本文对结直肠癌研究常见模型及类器官模型在结直肠癌中的研究进展作一综述。医学新知 2023 年 2 月第 33 卷第 1 期 New Medicine,Feb.2023,Vol.33,No.163https:/ 结直肠癌研究模型1.1 细胞系模型肿瘤细胞系是一种来源于肿瘤组织的二维平面细胞模型。Zhu 等研究利用 HCT116 等细胞模型发现 MyD88 基因的敲除可影响结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移3。此类模型具有经济快速、培养简单、无限增殖和可进行基因修饰与高通量药物筛选等优势，因此广泛应用于各类癌症研究中。但其来源细胞单一，培养传代过程中生物稳定性差，无法维持肿瘤细胞异质性且无法再现肿瘤组织多样性4。1.2 诱发性肿瘤动物模型诱发性肿瘤动物模型是指将致癌物作为诱导剂在实验动物体内诱发癌变的一类动物模型。Chartier 等研究通过偶氮甲烷联合葡聚糖硫酸钠做诱导剂的小鼠诱癌模型发现鸸鹋油可降低结肠炎相关大肠癌的严重程度5。诱发性肿瘤动物模型常用于观察肿瘤发生发展的全过程，但培养周期较长，不稳定性大，无法满足短期大量的研究需要。由于结直肠癌是一种多因素疾病6，此类模型用于结直肠癌的临床研究等方面局限性较大。1.3 肿瘤移植动物模型肿瘤移植动物模型是指将肿瘤细胞或组织种植到免疫缺陷动物体内而构建的临床前模型。根据移植部位不同可分为原位移植和异位移植。又根据肿瘤细胞的来源不同，分为人源性和鼠源性两类。其中，人源性肿瘤异种移植模型更接近人体肿瘤生长环境，且由于肿瘤细胞或组织来源于人体肿瘤标本，更大程度上维持了原始肿瘤的异质性7，可相对真实地反映出临床药物的疗效。Rivera 等的研究证实了人源性肿瘤异种移植模型可为识别生物标志物、验证信号通路等提供更多可能8。但在动物体内成瘤过程中可能会发生应激反应，因此无法完全模拟人体内成瘤过程；且实验动物和人类之间仍然存在物种差异，可能对评估药物药代动力学产生特殊影响9。此外，人源性肿瘤异种移植模型培养周期长，成功率不稳定，效率低，操作难，费用高，不易定向获取大量数据，难以大规模应用于临床试验，无法进行高通量药物筛选。1.4 肿瘤类器官模型肿瘤类器官是通过将肿瘤细胞在体外进行3D 培养形成的细胞团块样组织。Wang 等研究使用 IV 期结直肠癌衍生肿瘤类器官来评估化疗方案反应预测的准确性，药物疗效的敏感性、特异性、准确性、阳性预测率和阴性预测率分别为63.33%、94.12%、79.69%、90.48%和 74.42%10。肿瘤类器官模型可维持样本基因的稳定性，较大程度上还原了原始肿瘤的异质性。相比于传统肿瘤模型，肿瘤类器官模型无种族差异，伦理风险低，且培养周期短，成功率高，可大量培养，可用于高通量药物筛选或患者个性化医疗11。2 结直肠癌类器官的构建肿瘤类器官的培养要素包括肿瘤起始细胞、细胞外基质和生长调节因子。患者来源的结直肠癌类器官一般从手术切除的肿瘤标本或活检组织中获取肿瘤起始细胞。细胞外基质多选用基质胶作为组织架构为细胞提供附着点，并为细胞定向生长提供诱导及营养物质。为保证类器官不同阶段的生长需求，还需加入相关通路的激活剂或抑制剂等生长调节因子，一般结直肠癌类器官所需的细胞因子有上皮生长因子、Wnt 通路激动剂 R-spondin-1 蛋白、骨形态发生蛋白抑制剂 Noggin 蛋白、烟酰胺以及肿瘤坏死因子抑制剂A83-01 等12。此外，一般选用 adDMEM/F12 培养基作为基础培养基。2.1 3D培养法类器官的构建方法多样，常用的 3D 培养法简要步骤包括：肿瘤组织清洗浸泡；组织切碎，消化离心；细胞沉淀混胶，接板；加培养基，培养箱中培养。但该培养方法获得的类器官模型仅有上皮细胞，无癌症介质，如免疫细胞、成纤维细胞等2，更适用于抗癌药物的高通量筛选与单一机制研究。2.2 气-液培养法近年来出现的气-液培养法保留了肿瘤的免疫微环境，弥补了类器官无法进行肿瘤免疫相关研究的缺陷13。气-液培养法构建的类器官模型是一个双层的气-液界面交互的培养系统，以此来保留复杂的肿瘤微环境结构14。简要步骤包括：制备类器官气-液培养板；肿瘤组织切碎洗涤；碎组织混胶内皿接板；外皿加培养基，培养箱中培养。气-液培养法保留了原位的肿瘤实质和基质，同时包含特异性的肿瘤浸润淋巴细医学新知 2023 年 2 月第 33 卷第 1 期 New Medicine,Feb.2023,Vol.33,No.164https:/ 3D 培养法构建的类器官中没有的肿瘤组织原位基质和肿瘤微环境内源免疫细胞群15-16，为肿瘤免疫微环境的研究提供了新途径。3 结直肠癌类器官的应用现状结直肠癌类器官在结直肠癌发生机制、免疫微环境、抗癌药物筛选与新药研发、结直肠癌类器官生物样本库以及患者个性化医疗等方面应用广泛。3.1 结直肠癌发生机制研究结直肠癌的发生发展是一个多阶段、多基因突变积累的过程，但其分子生物学机制尚未完全阐明。结直肠癌由正常上皮细胞到腺瘤再到腺癌演变而来，该过程与部分基因密切相关。Matano等的研究采用 CRISPR-Cas9 基因技术编辑肠道类器官来模拟结直肠癌的演化过程，结果显示APC、KRAS、TP53 等基因突变促进了肿瘤的发展17。Fumagalli等的研究使用包含不同突变的结肠类器官证明了 Wnt、EGFR、p53 等信号致癌突变积累有助于肿瘤的生长和迁移18。Szvicsek 等的研究通过 Apc 基因突变的类器官发现 Apc 基因突变可导致 Wnt 信号通路的激活，从而导致肿瘤发生19。Ponsioen 等的研究使用 KRAS 和 BRAF 突变的结直肠癌类器官，发现癌基因驱动的信号传导在无 EGFR 活性的情况下受到显著限制，无法维持充分的增殖潜能，表明 EGFR 介导的 ERK 信号放大可以促进肿瘤生长20。通过类器官与基因编辑技术的结合，可证实或发现促癌基因，为结直肠癌的发生提供了有力证据。3.2 结直肠癌免疫微环境研究已开发的共培养类器官和气液培养法构建的类器官模型为肿瘤免疫微环境的研究提供了新途径15,21。淋巴细胞与肠道类器官共培养系统通过促进癌细胞和肿瘤浸润淋巴细胞间的直接接触，为阐明肿瘤诱导免疫抑制的机制提供了平台22。Qin 等研究通过小鼠肠道类器官与巨噬细胞和成纤维细胞共培养，发现这些基质细胞可在携带Kras 和 Trp53 突变的结肠上皮细胞中过度激活PI3K 信号通路23。Nozaki 等研究通过将肠上皮内淋巴细胞与肠类器官共同培养，发现在白细胞介素 2 等细胞因子存在的情况下，肠上皮内淋巴细胞可扩增24。Dijkstra 等的研究显示自体肿瘤类器官和外周血淋巴细胞的共培养可用于从错配修复缺陷型结直肠癌患者的外周血中富集肿瘤反应性 T 细胞21。Usui 等的研究通过气-液培养法建立患者结直肠癌类器官，与结直肠癌细胞系SW480、SW620 和 HCT116 相比，肿瘤类器官对 5-氟尿嘧啶和伊立替康的毒性有更强的耐受性25。因此类器官可模拟人体肿瘤微环境，从而更好地阐明癌症机制以及免疫治疗等相关难题。3.3 抗癌药物筛选与新药研发放化疗是晚期结直肠癌和癌转移患者主要的治疗方法。类器官技术发展至今，已成为抗癌药物筛选的重要模型。5-氟尿嘧啶是一种常用的抗癌药物，有研究显示 5-氟尿嘧啶可能通过某些途径促进肿瘤复发。Cho 等的研究使用患者来源的结直肠癌类器官证实了 5-氟尿嘧啶可通过WNT/-catenin 途径诱导肿瘤干细胞的激活，表明 5-氟尿嘧啶与 WNT 抑制剂的联合应用可能是避免肿瘤复发的有效途径26。Ganesh 等的研究使用植入不同直肠癌类器官的小鼠模型模拟化疗反应，结果显示植入临床侵袭性较差的直肠癌类器官的小鼠对 5-氟尿嘧啶或 FOLFOX 化疗的反应更敏感27。Pauli 等研究结合晚期结肠癌患者基因突变数据和结肠癌类器官生物样本库，筛选相应的靶向药物，并探索药物联合应用的有效性，结果显示阿法替尼和伏立诺他的联合使用可显著抑制植入具有 APC 突变类器官的小鼠的肿瘤生长，且肿瘤体积仅为 FOLFOX 化疗治疗的 10%28。Costales-Carrera 等 的 研 究 表 明，Plocabulin（PM060184,C31H45N3O7）在结直