框架核酸高通量检测芯片_宋璐.pdf

Chem.J.Chinese Universities,2023,44(2),2022056320220563(1/7)CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES高 等 学 校 化 学 学 报研究论文框架核酸高通量检测芯片宋璐1，2，3#，张舒阳3#，王丽华1，左小磊3，李敏3（1.中国科学院上海应用物理研究所物理生物学实验室,中国科学院界面物理与技术重点实验室,上海 201800；2.中国科学院大学,北京 100049；3.上海交通大学医学院分子医学研究院,上海市核酸化学与纳米医学重点实验室,上海200127）摘要 构建了一种基于框架核酸的高通量生物检测芯片.利用超微量移液自动化平台,将包含框架核酸探针的液滴按照预设命令固定至生物芯片微阵列上,在探针捕获核酸靶标后利用集成的基因芯片扫描仪对芯片进行成像,通过分析荧光强度定量化分析靶标浓度.结果表明,此框架核酸芯片能够实现框架核酸探针的高通量制备,24 h即可制备具有15万个点的微阵列,且点间距离的相对偏差W10%、荧光强度的变异系数CV=3.30%,具有较高的稳定性,远高于国家标准.此外,该芯片具备高灵敏度、可寻址的高通量生物分析能力,对核酸靶标的检测限可达100 pmol/L.随着多种探针技术的发展,生物检测微阵列技术在高通量生物分析领域展示出巨大的潜力.关键词 高通量检测；框架核酸；核酸靶标；生物微阵列芯片中图分类号 O657 文献标志码 A doi：10.7503/cjcu20220563High-throughput Biological Microarrays Based on Framework Nucleic AcidsSONG Lu1，2，3#，ZHANG Shuyang3#，WANG Lihua1，ZUO Xiaolei3，LI Min3*（1.Division of Physical Biology，CAS Key Laboratory of Interfacial Physics and Technology，Shanghai Institute of Applied Physics，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201800，China；2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China；3.Institute of Molecular Medicine，Shanghai Key Laboratory for Nucleic Acid Chemistry and Nanomedicine，School of Medicine，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200127，China）Abstract A high-throughput biological microarray based on framework nucleic acid（FNA）was constructed.Using an automated ultra-micro pipetting platform，the droplets containing FNAs-based probes were fabricated onto the glass substrates according to the pre-defined commands.After the targets were captured by the probes，the micro-arrays were scanned by the integrated gene chip scanner，the results of which could be further used for the quantifi-cation of target concentration.It was found that the FNA probes could be prepared with high throughput on the bio-logical microarrays，and the microarrays with 150000 spots can be prepared within 24 h.Moreover，the relative deviation（W）of distance between the points is less than 10%，and the coefficient of variation（CV）of fluorescence intensity is 3.30%.The properties of each spot on the microarrays were stable，which is much higher than the national standard.Additionally，we demonstrated that the FNA-based microarray possessed high addressability，high sen-sitivity and high-throughput capabilities.The limit of detection for nucleic acid target was down to 100 pmol/L.With 收稿日期：2022-08-23.网络首发日期：2022-10-13.联系人简介：李 敏,女,博士,副研究员,主要从事DNA纳米技术方面的研究.E-mail:基金项目：国家重点研发计划项目(批准号:2021YFF1200300，2020YFA0909000)和国家自然科学基金(批准号:21904086)资助.Supported by the National Key Research and Development Program of China(Nos.2021YFF1200300，2020YFA0909000)and the National Natural Science Foundation of China(No.21904086).#共同第一作者.CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES高 等 学 校 化 学 学 报研究论文Chem.J.Chinese Universities,2023,44(2),2022056320220563(2/7)the progress of various probe technologies，the microarray platform shows great potential for bioanalysis.Keywords High-throughput detection；Framework nucleic acid；Nucleic acid target；Biological microarray核酸检测是一种预防和诊断传染病的重要手段，如广泛使用核酸检测来监测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的流行病学分布情况13.此外，基因过度表达、表达不足以及基因突变与多种疾病相关46.SARS-CoV-2感染的临床急性时期，在唾液和鼻咽拭子等临床样本中可检测到病毒RNA.由于在感染SARS-CoV-2病毒的第4天左右病毒载量达到峰值，在感染后的前5天内完成病毒RNA的检测是实现病毒检测的关键，因此实现对大规模人群的及时检测需要高通量、操作简单的检测技术.目前，临床检验中的核酸检测大多数基于实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR）技术，然而传统实时荧光定量PCR需要严格控制样品制备的温度，且存在技术复杂、检测时间缓慢、设备维护昂贵、需要专业人员和检测通量较低等局限，远不能满足高通量核酸检测的需求，限制了分子生物学临床转化的发展713.2019年新冠疫情爆发以来，核酸检测的需求量与日俱增14.随着“15 min核酸采样圈”等常态化核酸检测措施的发布，亟需建立完善、高效运转的核酸检测系统.为了提高检测效率，核酸检测通常采用混采样本进行检测，一个大型中心实验室的核酸检测日产能为1015万管，而对于千万级以上人口城市来说，仍然不能满足核酸检测常态化的需求.近年来，高通量测序等技术的快速发展为高通量核酸检测提供了多种重要的技术平台1519.高通量测序一次可以实现对几十万条DNA分子的序列测定，凭借其高通量和测序快的优势可以提供丰富的核酸序列信息，而且显著缩短了检测时间20，21.目前，高通量测序已经成为组学研究的主要技术，广泛用于基因组分析和转录组分析22，23.Koren课题组24从数千个单细胞的全基因组测序结果中分析DNA复制现象，揭示了DNA复制起始时间的可变性；Wrana课题组25从临床样本中提取RNA，并进行高通量测序，证实了高通量测序用于大规模监测SARS-CoV-2的可行性.然而，高通量测序用于核酸检测仍有很多问题需要解决：测序数据量庞大导致储存和分析困难以及操作过程繁琐使其难以应用于临床诊断.具有大规模、高通量分析能力的生物检测微阵列芯片，极大地促进了生物分析领域的发展.制备高性能生物检测芯片的关键在于识别探针在生物芯片上的固定.目前，研究人员发展了表面修饰和生物分子固定化的策略，用于制备高性能的生物检测微阵列芯片26，27.然而，这些研究仍然无法解决空间位阻、静电相互作用和探针的空间排布等问题.DNA纳米技术能够自下而上地构建可控性好、精密度高的DNA纳米结构，已广泛应用于结构制造和传感领域28.其中，三维的、具有正四面体结构的框架核酸由于具有较好的刚性和结构稳定性，被广泛应用于界面上固定生物分子29.该框架核酸结构可以将连接的探针以特定的方向固定在传感界面上，从而以特定的方向捕获生物分子，实现探针捕获效率的最大化.本文构建了基于框架核酸（FNA）的探针，发展了一种集成了超微量移液自动化平台和高通量基因芯片扫描仪的高通量生物微阵列检测芯片.利用框架核酸在界面上对探针的调控能力，预先将检测探针固定在框架核酸基底上，利用超微量移液自动化平台对生物微阵列芯片进行编程，从而驱动框架核酸探针在生物芯片上的高通量自动分配.探针捕获核酸靶标后，利用集成基因芯片扫描仪对该芯片进行成像，每个包含不同浓度核酸靶标的生物芯片微阵列的荧光强度与靶标浓度具有较好的线性相关性，而基于单链探针的生物芯片微阵列的荧光强度远低于框架核酸生物芯片微阵列.因此构建的框架核酸高通量生物检测芯片能够简单、准确和快速地实现对核酸靶标的高通量检测，从而推动分子生物学临床转化的发展30，31.1 实验部分1.1试剂与仪器基因芯片点样液，北京博奥生物有限公司；实验所用其它试剂均购于生工生物工程（上海）股份有限公司.框架核酸探针自组装溶液为 TM buffer 20 mmol/L Tris+50 mmol/L MgCl2，pH=8.0，用MilliporeCHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES高 等 学 校 化 学 学 报研究论文Chem.J.Chinese Universities,2023,44(2),2022056320220563(3/7)系统的Milli-Q超纯水（18 M cm电阻）配制；聚丙烯凝胶电泳缓冲液为1TBE 购于生工生物工程（上海）股份有限公司，pH=7.4；洗涤液为1PBS 购于生工生物工程（上海）股份有限公司，pH=7.4 和PBST（1PBS+体积分数0.5%的Tween20，pH=7.4）；封闭液为1PBS与体积分数25%乙醇混合液配制的2.5 mg/mL NaBH4溶液，pH=7.4.DNA链由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如表1所示.晶芯光学级醛基基片购于北京博奥生物有限公司；Agilent