枯草芽孢杆菌HG-02聚谷氨酸发酵条件优化_虎恩熊.pdf

2023 年 1 月云南化工Jan 2023第 50 卷第 1 期Yunnan Chemical TechnologyVol.50，No.1doi:10.3969/j.issn.1004-275X.2023.01.14枯草芽孢杆菌 HG 02 聚谷氨酸发酵条件优化虎恩熊，贾勇正，钱栋全，李伟建，孙芳芳(云南润杰农业科技股份有限公司，云南昆明650000)摘要:筛选得到了一株高产 聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌 HG 02。通过单因素试验和正交实验对发酵培养基和培养条件进行了优化，小试发酵验证结果显示，优化后 聚谷氨酸的发酵质量浓度达 35.9 g/L。优化后的发酵培养基为:蔗糖 4%，蛋白胨 3.5%，谷氨酸钠 6%，硫酸镁 0.1%，氯化钠 0.5%，氯化钙 0.01%，磷酸氢二钾 0.05%，硫酸锰 0.02%，消泡剂 1%。优化后的培养条件为:初始 pH7.0，装液量 40%，接种量 6%，摇床转速为 220 r/min，37 恒温培养 48 h。关键词:聚谷氨酸;发酵;苦草芽胞杆菌优化中图分类号:TS202文献标识码:A文章编号:1004 275X(2023)01 0050 04Optimization of Fermentation Conditions of Polyglutamic Acid by Bacillus Subtilis HG 02Hu Enxiong，Jia Yongzheng，Qian Dongquan，Li Weijian，Sun Fangfang(Yunnan unjie Agricultural Technology Co，Ltd，Kunming 650000，China)Abstract:A high yield plant of Bacillus subtilis HG 02 with polyglutamic acid was selected The fermentation medium and conditionswere optimized by single factor experiment and orthogonal experiment The optimized fermentation medium is:sucrose 4%，peptone 3.5%，so-dium glutamate 6%，magnesium sulfate 0.1%，sodium chloride 0.5%，calcium chloride 0.01%，potassium hydrogen phosphate 0.05%，manganese sulfate 0.02%，defoamer 1%The optimized culture conditions were as follows:initial pH 7.0，liquid volume 40%，inoculationvolume 6%，shaking table speed 220 r/min，constant temperature incubation at 37 for 48 hKey words:Poly glutamic acid;liquid fermentation;orthogonal test 聚谷氨酸(PGA)是由 D /L 谷氨酸单体通过 酰胺键连接而成的一种直链纤维状生物大分子1，是一种具有生物可降解性、保湿性、高吸水性、成纤维性、生物相容性、可食用性和超强的吸附性等特性的不具毒性的新型天然高分子2，被广泛运用于食品、医药、环保、化妆品和农业等多个领域。目前 聚谷氨酸的生产制备主要采用微生物发酵法，在 聚谷氨酸发酵生产中，细菌中芽孢杆菌属类是应用最多的，其中以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌为典型代表3。微生物发酵法生产 聚谷氨酸，发酵工艺和生产菌株是主要的影响因素，本文通过对实验室现有产 聚谷氨酸菌株的筛选和发酵条件优化，以期实现 聚谷氨酸高产量和高效率生产。1材料与方法1.1材料与仪器化学试剂:蔗糖、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、柠檬酸、甘油、酵母浸粉、谷氨酸钠、硫酸镁、氯化钠、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸锰、消泡剂、95%乙醇(除消泡剂外，其余化学试剂均为分析纯)。仪器:恒温摇床，无菌操作台，灭菌锅，恒温培养箱，电子天平，50 L 发酵罐，紫外分光光度计。1.2培养基与培养条件1.2.1培养基平板培养基:蛋白胨0.8%，牛肉膏0.3%，氯化钠 0.5%，葡萄糖 0.25%，琼脂 1.6%，自然 pH;灭菌条件:121，20 min。种子培养基:葡萄糖 1%，蛋白胨 1%，谷氨酸钠 2%，硫酸镁 0.1%，氯化钠 0.5%，磷酸氢二钾0.05%，pH7.0;灭菌条件:121，20 min。初始发酵培养基:蔗糖 3.5%，蛋白胨 2%，谷氨酸钠 4%，硫酸镁 0.1%，氯化钠 0.5%，氯化钙0.01%，磷酸氢二钾0.05%，硫酸锰0.02%，消泡剂1%，pH7.0;灭菌条件:121，20 min。1.2.2培养方法平板活化培养:在无菌条件下，挑取一环保存于4 冰箱的枯草芽孢杆菌株种接种于平板培养基中，37 恒温培养 12 14 h，作为一次活化菌种。将一次活化菌种接种于新鲜平板培养基中，37 下静置培养 12 14 h，作为二次活化菌种。种子培养:在无菌条件下，挑取平板培养好的二次活化菌种接种于摇瓶种子培养基上，置于摇床上200 r/min，37 恒温培养约 12 14 h，待 OD600大于8 时取出为种子液备用。发酵培养:以 3%的接种量将种子培养液接种到250 mL 三角瓶中，按照发酵液初始 pH7.0，发酵转速200 r/min，发酵温度 37，装液量 60%即 150 mL 进行恒温培养 72 h。1.3高产 聚谷氨酸菌株筛选挑选实验室现有的 8 株产 聚谷氨酸菌株，分别接种于平板培养基活化后，在无菌条件下接种至种子摇瓶上，待 OD600值大于 8 时接种至发酵摇瓶上进052023 年 1 月云南化工Jan 2023第 50 卷第 1 期Yunnan Chemical TechnologyVol.50，No.1行发酵培养，37 恒温培养 72 h 后测定 聚谷氨酸产量，对比得到聚谷氨酸产量最高的菌株 HG 02，其最终产量为 21.3 g/L。菌株 HG 02 经 16 s rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌，为谷氨酸依赖性菌株。聚谷氨酸质量浓度采用酒精法测量:取 10 mL 发酵液，10000 r/min 离心30 min，去除菌体。加入3 倍体积的 95%乙醇，充分搅拌待聚谷氨酸析出后，加入蒸馏水进行重溶，再加入 3 倍体积的 95%乙醇析出聚谷氨酸，反复溶 3 次后，将聚谷氨酸置于 50 烘干至恒重，得到聚谷氨酸质量浓度。1.4单因素试验优化初始发酵培养基1.4.1氮源种类与质量浓度筛选以初始发酵培养基为基础，分别设置不同的氮源:牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉，其它条件相同，通过发酵培养测定聚谷氨酸质量浓度获得最佳氮源。再设置最佳氮源的添加量分别为 30 g/L，35 g/L，40 g/L，45 g/L，50 g/L。每个试验组设置 3 个平行，37 恒温培养72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。1.4.2碳源种类与质量浓度筛选以初始发酵培养基为基础，分别设置不同的碳源:蔗糖、葡萄糖、柠檬酸，其它条件相同，通过发酵培养测定聚谷氨酸质量浓度获得最佳碳源。再设置最佳碳源的质量浓度分别为 20 g/L，25 g/L，30 g/L，40 g/L，45 g/L。每个试验组设置 3 个平行，37 恒温培养 72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。1.4.3谷氨酸钠添加量筛选对于谷氨酸依赖型菌株，发酵培养基中必须有谷氨酸存在才能合成聚谷氨酸，如果培养基中没有谷氨酸，则不能合成聚谷氨酸 4。谷氨酸钠的质量浓度就显得非常重要，设置质量浓度分别为 30 g/L，40 g/L，50 g/L，60 g/L，70 g/L。每个试验组设置 3 个平行，37 恒温培养72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。1.5单因素试验优化发酵工艺1.5.1摇瓶转速筛选发酵培养基的转速影响发酵体系的物质传递、氧气传递5。为探寻发酵中最佳摇瓶转速，分别设置转速 为 160 r/min，180 r/min，200 r/min，220 r/min，240 r/min。每个试验组设置 3 个平行，37 恒温培养 72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。1.5.2接种量筛选接种量影响发酵液中菌体的富集速度和含量，从而影响产物的积累。为探寻发酵中最佳接种量，分别设置接种量为 3%，4%，5%，6%，7%。每个试验组设置 3 个平行，37 恒温培养 72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。1.5.3初始 pH 值筛选pH 对微生物的生长和代谢产物生成都有很大影响，不同的微生物对 pH 值的要求是不同的，为探寻发酵中最佳初始 pH 值，分别设置初始 pH 值为6.4，6.6，6.8，7.0，7.2。每个试验组设置 3 个平行，37 恒温培养72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度产量。1.5.4发酵温度筛选从酶反应动力学来看，温度升高，反应速度加大，生长代谢加快，产物生成提前。但是，温度越高酶失活越快，菌体易于衰老，影响产物的生成。为探寻发酵过程中的最佳温度，分别设置发酵温度为 32，34，36，38，40。每个试验组设置 3 个平行，37 恒温培养72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。1.5.5发酵时间筛选发酵时间的长短直接关系到产物的积累，为探寻最佳发酵时间，分别设置发酵时间为 24 h，36 h，48 h，60 h，72 h。每个试验组设置 3 个平行，37 恒温培养 72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。1.5.6装液量筛选装液量影响发酵液的溶氧，为探寻最佳发酵装液量，分别设置装液量为 20%，30%，40%，50%，60%。每个试验组设置 3 个平行，37 恒温培养72 h 后，测定发酵液中聚谷氨酸质量浓度。1.6正交试验优化发酵条件根据单因素实验情况，选择培养基及含量、发酵温度、初始发酵 pH、接种量、装液量等来确定最优的发酵条件。正交试验表根据实际情况选择，每组试验设置 3 个平行，通过测定最终 聚谷氨酸质量浓度确定最佳发酵条件。1.7小试发酵根据单因素试验和正交试验结果进行 50 L 罐子小试发酵试验，验证优化后的发酵条件。种子液接种方法为火焰接种法，从发酵开始每隔 2 h 记录 pH 和溶氧的变化，同时发酵 12 h 后每隔 2 h 取样测量 聚谷氨酸质量浓度直至发酵结束。2结果与讨论2.1单因素试验优化培养基成分采用 250 mL 三角瓶进行单因素优化发酵试验，按照发酵初始 pH7.0，发酵转速 200 r/min，发酵温度37，装液量 150 mL，接种量 4%进行培养，发酵时间 48 h，发酵完成后检测发酵终点发酵液中的 聚谷氨酸质量浓度，按 聚谷氨酸质量浓度来确定培养基最优成分及用量。发酵试验结果如图 1，图 2，图 3，图 4，图 5 所示。图 1不同氮源对 聚谷氨酸质量浓度的影响152023 年 1 月云南化工Jan 2023第 50 卷第 1 期Yunnan Chemical TechnologyVol.50，No.1图 2不同碳源对 聚谷氨酸质量浓度的影响图 3蔗糖含量对 聚谷氨酸质量浓度的影响图 4蛋白胨含量对 聚谷氨酸质量浓度的影响图 5谷氨酸钠含量对 聚谷氨酸质量浓度的影响由图可知，菌株 HG 02 发酵生产 聚谷氨酸的最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为蛋白胨，其中蔗糖最佳质 量 浓 度 为 40 g/L，蛋 白 胨 最 佳 质 量 浓 度 为35 g/L，谷氨酸钠最佳质量浓度为 50 g/L。2.2单因素试验优化发酵工艺采用 250 mL 三角瓶进行单因素优化发酵试验，按照单因素优化的培养基配方蔗糖 4%，蛋白胨 4%，谷氨酸钠 5%，硫酸镁 0.1%，氯化钠 0.5%，氯化钙0.01%，磷酸氢二钾0